糖尿病视网膜病变患者血清miRNA的临床价值△

代宝珠 代艳

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是目前成年人(20～65岁)视力下降和失明的主要原因[1]。由视网膜毛细血管和视网膜色素上皮组成的血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)能够阻止视网膜神经因子和循环炎症细胞分泌的细胞毒性产物的进入，从而保护和允许视网膜调节细胞外化学物质成分[2]。长期的高血糖对视网膜微血管系统造成的损害是导致BRB失衡的关键。BRB失衡进而使血管内液体和脂质等物质渗漏到视网膜，并加重DR的进展[3]。DR的发病机制是一个多因素作用过程，已有研究证实，许多与高血糖发病相关途径的蛋白编码基因参与其中[4]。近年有研究发现[5]，大量的非编码RNA在DR的发病机制中起着重要的作用，其中微小RNA(microRNA，即miRNA)尤其受到关注。miRNA是一组短的(21～23个核苷酸)、高度保守的内源RNA，不编码蛋白质[6]，但可通过与靶基因的3’-非翻译区(3’-UTR)的配对结合，诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译来调节基因的表达[6]。已有研究表明[7]，miRNA参与视网膜细胞的增生、迁移和凋亡以及与DR相关的新生血管形成过程。同时，DR患者血清中也存在着miRNA-451、miRNA-221、miRNA-200b的异常表达[8]。然而，其在DR患者中的临床意义尚未完全清楚，基于此进行了以下研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月至12月在本院内分泌科住院治疗的单纯2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者60例及眼科住院治疗的DR患者60例(非增生型DR 54例，增生型DR 6例)纳入本研究。DM组患者均符合世界卫生组织制定的DM诊断标准[9]。纳入标准：DR组患者经裂隙灯显微镜、间接检眼镜及荧光素眼底血管造影检查，符合DR临床诊断标准[10]。排除标准：合并肿瘤及内分泌疾病者、急慢性感染者、严重肝肾功能不全者，合并白内障、青光眼等其他眼部疾病者，孕妇及哺乳期女性。DM组患者中，男29例，女31例；年龄35～81(63.5±10.1)岁；DM病程10～25(10.9±11.5)a。DR组患者中，男32例，女28例；年龄40～85(65.2±10.3)岁；DM病程10～25(15.4±10.2)a。DM组和DR组间男女构成比、年龄比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。本研究经本院伦理委员会审批并获取所有受检者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集所有受检者禁食8 h后抽取受检者静脉血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4 ℃、3000 r·min-1离心15 min，血清通过全自动生化分析仪(美思康 MC6600)检测患者空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、肌酐(creatinine，Cr)及血尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)，比浊法检测尿白蛋白/肌酐(urinary albumin/creatinine，UACR)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbAlc)，所用试剂盒均购自北京原子高科股份有限公司，并严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.2 miRNA提取本研究选用miRNA Purification Kit试剂盒(康为世纪)进行提取。室温下解冻血清样品，取200 μL血清样品，加入5倍体积TRizon Reagent反复吹打，使蛋白核酸复合物完全分离，离心5 min，取上层无水相于离心管中，加入1/3无水乙醇，过柱，洗柱2次。向吸附柱RS中加入700 μL Buffer RWT离心后倒掉废液，重新将吸附柱RS(Spin Columns)中加入500 μL Buffer RWT离心后倒掉废液，重复2次，向得到的吸附柱中间部位加入30～50 μL RNase-Free Water，离心后将收集到的RNA液保存至-80 ℃冰箱。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测根据miRNA cDNA Sythesis Kit逆转录试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测。RT-PCR仪(Bio-Rad伯乐T100)扩增目的基因片段，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，56 ℃ 1 min，共40个循环。设计miRNA的反转录引物和RT-PCR扩增序列(5’-3’)(PCR检测时上下游引物成对)引物见表1，miRNA相对表达量用2-△△Ct表示。每个样本独立重复实验3 次。

表1 引物信息

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。如果数据符合正态分布则采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，采用Pearson法分析miRNA与血清生化指标之间的相关性，多因素Logistic回归分析DR发生的危险因素，ROC曲线分析miRNA对DR的诊断价值。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 两组患者血清临床生化指标比较DM与DR两组间的血清生化指标检测结果显示，两组间 TC、LDL-C、TG、Cr 及 BUN水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)，而DR组UACR、HbAlc 及 FPG均明显高于DM组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表2。

表2 两组患者血清临床生化指标比较

2.2 两组患者血清中3种miRNA表达水平比较3种血清miRNA的数据符合正态分布，DM组中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b水平均明显低于DR组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 两组血清中3种miRNA表达水平比较。A：miRNA-451相对表达量；B：miR-221相对表达量；C：miR-200b相对表达量

2.3 血清中3种miRNA与生化指标的相关性Pearson 相关性分析结果显示，DR 组患者血清各miRNA与UACR、HbAlc及FPG均呈正相关(均为P<0.05)，miRNA-451与miRNA-221(r=0.402，P=0.022)、miRNA-200b(r=0.768，P<0.01)，以及miRNA-221与miRNA-200b之间(r=0.698，P<0.01)相互呈正相关关系。见表3。

表3 血清中3种miRNA与生化指标的相关性

2.4 多因素Logistic回归分析DR发生的危险因素对两组患者血清生化指标和miRNA进行多因素Logistic回归分析，结果显示，UACR、HbAlc、FPG、miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b是DR发生的独立危险因素。见表4。

表4 多因素Logistic回归分析DR发生的危险因素

2.5 血清中3种miRNA及三项联合对DR的诊断价值对miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b进行ROC曲线分析，曲线下面积分别为0.722、0.823及0.761，具有较高的诊断价值。以各miRNA为自变量建立Logistic回归模型，y=-12.066 8+1.460 85X1+1.387 97X2+0.332 92X3，X1=miRNA-451,X2=miRNA-221,X3=miRNA-200b，曲线下面积为0.938，大于单一检测任一miRNA的曲线下面积。见表5。

表5 3种miRNA及三项联合对DR的诊断价值

3 讨论

DR最主要的特征是高血糖损害视网膜微血管系统，导致代偿性新生血管化[11]。近年的研究发现，小型非编码RNA分子在血管内皮细胞和周细胞等的信号通路调节中起着重要的作用[12]。在DR患者视网膜中已发现有超过80种小分子RNA表达异常升高，6种表达下调，且部分被证实与DR发生发展存在相关性[13]。小分子RNA可通过调节miRNA和蛋白质水平上的基因表达，以增强细胞死亡和减少血管内皮增生来调控血管的生成[14]。因此，在DR的发生发展过程中可能存在着一种或多种特殊的血清miRNA表达模式，可以作为一种新的非侵入性方法来早期预测DR。

本研究结果显示，DR组中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b较DM组明显升高，说明这3种miRNA在DR组患者血清中异常高表达，可能与视网膜病变存在相关性。已有研究认为[15]，在高糖微环境下，视网膜色素上皮细胞中miRNA-451表达异常升高。在本研究中，DR组患者血清中FPG明显高于DM组，与此结果相符。而通过RF/6A细胞实验已证实[16]，下调miRNA-451水平后，细胞迁移明显下降，使由迁移行为介导的管腔形成能力受到抑制，从而阻碍增生膜的形成，说明下调miRNA-451表达对降低DR的发生率有利。另有研究发现[17]，miRNA-221通过在血管内皮细胞中高度表达来发挥抗增生、抗迁移和促凋亡作用。miRNA-221主要影响c-kit(即干细胞因子受体)，其在内皮祖细胞迁移和归巢中起着关键作用，内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，又称为成血管细胞。在高血糖的环境下，miRNA-221是在人脐静脉内皮细胞中诱导的，它能有效地触发对c-kit的抑制和对HUVEC迁移的损害[18]。因此，在DR患者的血管内皮生成方面起抑制作用。此外，miRNA-200b过度表达下调抗氧化基因，该基因具有保护视网膜细胞抵抗凋亡和氧化应激的作用。氧化应激的增加可导致氧化还原敏感转录因子的激活，进而改变包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在内的许多基因的表达[19]。Li等[20]报道，miRNA-200b和VEGF之间存在明显的负相关关系，这也从另一个侧面证明VEGF可能是miRNA-200b的靶基因。因此，miRNA可能在DR的发生发展过程中发挥着重要的作用，检测 miRNA-451、miRNA-221及 miRNA-200b在血清中的表达水平，有助于对DR发病机制的研究，并为靶向干预治疗提供新的策略。

本研究还发现，UACR、HbAlc、FPG、miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b是DR发生的独立危险因素，且各miRNA分别与UACR、HbAlc、FPG之间呈正相关关系，三者之间也呈正相关关系，提示这3种miRNA可能与DR发生发展及其微血管病变密切相关。因此，miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b水平显著上调可能是DR病情加重的早期信号，应引起临床重视，尽早采取有效的措施控制病情进展。本研究中3种miRNA ROC曲线分析结果表明，三者联合检测的评估价值优于单项miRNA检测。

综上所述，DR患者存在着血清中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b的异常高表达，这些miRNA可能参与了DR的发生发展过程。因此，血清中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b检测可以作为DM患者向DR发展的一种新的非侵入性风险评估生物学指标，有望为DR的早期预防和早期诊断提供新的研究方向。