不同照射方式下核黄素-A波紫外线兔巩膜胶原交联术对兔巩膜成纤维细胞生物力学特性的影响

韩宝雁 侯玉荣 陈博宇

近视为眼科的常见病，目前发病率呈逐年上升的趋势。近视发病机制主要为在环境和遗传因素的共同作用下，巩膜生物力学特性的改变诱导巩膜发生了主动重塑，进而造成了眼轴的拉长。作为巩膜主要组成细胞的巩膜成纤维细胞，其力学特性及细胞信号传递通路的改变在高度近视的形成中起到至关重要的作用。巩膜交联术是近年来开展的一项新技术，能增强巩膜自身生物力学强度，阻止巩膜的扩张，防治进行性近视发生。目前，国际上兔眼巩膜交联研究中普遍采用370 nm的A波紫外线 (ultraviolet A，UVA)，功率3 mW·cm-2，照射时间30 min，总能量为5.4 J·cm-2[1]。本实验采用两种总能量相同(5.4 J·cm-2)，但功率及照射时间均不同的照射方式对新西兰兔鼻上方巩膜进行核黄素-UVA交联，旨在通过细胞微管吸吮实验，探讨不同照射方式下核黄素-UVA巩膜交联术前后巩膜成纤维细胞的细胞黏弹性变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物取健康新西兰大白兔24只，无眼部疾患，雌雄兼用，随机将兔平均分为A、B两组，每组均选取左眼为实验眼，右眼为对照眼。

1.1.2 试剂与仪器注射用核黄素磷酸钠(珠海经济特区生物化学制药厂)，羟糖苷滴眼液(美国Alcon公司)，二甲基亚砜(美国 Gibco公司)；微管吸吮系统包括微机械手、倒置显微镜、显微图像分析系统、电子数显高度尺(XKG300，北京量具刃具厂)，细胞小室、可调节水位的水箱、计算机1台、37～38 ℃林格氏液的环境箱(以上生物力学的仪器由太原理工大学应用力学研究所提供)。

1.1.3 主要试剂的配制5-磷酸核黄素：将5 mL羟糖苷滴眼液与5 mg注射用核黄素磷酸钠溶液混合、摇匀。丁卡因眼液：注射用丁卡因5 mg与生理盐水注射液5 mL混合、摇匀。DMEM培养液(即细胞培养液)：由体积分数20%的胎牛血清、100×103U·L-1的青霉素、100 mg·L-1的链霉素配制而成。

1.2 实验方法

1.2.1 核黄素-UVA兔巩膜胶原交联术每组选取左眼为实验眼，右眼为对照眼，水合氯醛合剂(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉实验兔，开睑器开睑，将内外直肌间的上方的球结膜及筋膜充分分离，上方角膜缘6-0牵引线拉向颞下方，充分暴露鼻上方巩膜(图1)；在暴露区滴加5-磷酸核黄素溶液，浸润5 min，然后用波长370 nm的紫外线灯聚焦照射暴露区(图2)。A组的照射时间为30 min，能量密度为3.0 mW·cm-2；B组的照射时间为9 min，能量密度为10.0 mW·cm-2。照射期间，每2 min滴加1次5-磷酸核黄素溶液，以保持巩膜的湿润。

图1 术中接受紫外照射的鼻上象限巩膜的暴露。图2 紫外交联仪正在照射暴露的交联部位巩膜

1.2.2 兔巩膜成纤维细胞的原代培养及鉴定术后60 d，取实验眼照射部位的巩膜组织，及对照眼相应部位的巩膜组织，用眼科显微剪刀将巩膜组织剪成1 mm×1 mm的碎块，采用组织块培养法培养实验兔的巩膜成纤维细胞，用免疫细胞化学法对培养的细胞进行鉴定。

1.2.3 细胞微管吸吮系统微管实验腔是由两块干净的盖玻片、一个中间开口的不锈钢架子组成。细胞悬液注入微管实验腔时，液体靠表面张力的作用而悬浮于盖玻片上，微管可以从腔体的两侧开口处进入。当细胞悬液约0.5 mL(106个·mL-1)加入微管实验腔后，可用放大的油镜和目镜观察待测细胞，然后用显微操作手缓慢地将微管尖端靠近细胞表面，通过压力控制系统对微管产生阶跃式负压以吸吮细胞，使细胞的一小部分被吸入微管内。阶跃式负压是指首先给待测细胞施加0.01 kPa的负压，随后调节压力，对待测细胞逐步施加0.02 kPa的阶跃式负压，细胞达到稳态后，再记录细胞被吸入的长度和相应负压值。依细胞的差异而调节施加负压的范围，使吸入的长度小于微管的内径，以保证细胞的变形在弹性范围之内。

1.2.4 力学模型根据半无限体模型可推出细胞的弹性模量E：

△p表示吸入负压，a表示微管内径，L表示吸入长度。实验结果中，n为各实验组所测量细胞的个数，各组细胞的弹性模量E则经过Origin Pro 8.0统计，最终结果以均数±标准差来表示。我们利用标准线性的黏弹性固体模型来描述细胞的黏弹性行为：在阶跃式的负压△p作用下，吸入长度L与时间的关系式为

τ为△p作用下变形松弛的时间，μ为表观黏性系数，E0为瞬态弹性模量，E∞为平衡弹性模量。参数A与参数B均可以由拟合曲线得出。利用OriginPro 8.0软件对给定负压的平均吸入长度曲线，进行指数拟合。其中n为各组中测量细胞的总数。

1.3 统计学方法应用 SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 细胞培养结果原代培养：组织块培养3～5 d后，新分裂的游离细胞多呈现为小的三角形或星形，约10 d后细胞生长为新生细胞体积的2～3倍。形态呈长梭形，10～14 d后细胞进入分裂增殖旺盛的对数生长期。传代培养：传代接种的细胞密度为109个·L-1，约2 h即可贴壁，按12的比例传代，7～14 d传代1次。

2.2 巩膜成纤维细胞鉴定结果用免疫细胞化学法鉴定显示巩膜成纤维细胞Vimentin染色呈阳性，细胞浆内可见清晰的棕黄色阳性反应产物，Desmin染色以及Keratin染色均呈阴性，S-100染色也呈阴性，上述观察结果表明所提取并培养的细胞为巩膜成纤维细胞。

2.3 巩膜成纤维细胞微管吸吮实验结果A、B两组实验眼巩膜细胞的杨氏模量、表观黏性均较各自对照眼显著增强，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；而A、B两组实验眼间及对照眼间巩膜细胞的杨氏模量、表观黏性差异均无统计学意义(均为P>0.05)。以上结果表明，交联术后巩膜细胞的黏弹性发生了明显的变化，黏弹性显著升高。而两种照射方式之间巩膜细胞的黏弹性无显著差异(见表1)。

表1 各组巩膜成纤维细胞的细胞生物力学性能数据分析表

注：与同组对照眼比较，*P<0.05

3 讨论

病理性近视的特点是眼轴出现进行性增长、巩膜厚度变薄(尤其易发生在巩膜后极部)，严重时可引起后巩膜葡萄肿[2-3]。近年来多项临床及实验研究表明，巩膜的主动重塑在眼球发育、正视化发展以及近视形成的过程中起着十分重要的作用。国外学者发现通过紫外线-核黄素诱导交联的方法，可以加强角膜及巩膜组织的机械强度，阻止圆锥角膜及进行性近视的病理进程[4-5]。目前国际上已将此方法用于临床治疗角膜疾病，但对于巩膜胶原交联的研究目前还处在基础实验研究阶段[6-9]。Wollensak等[6]对人及实验动物兔巩膜行核黄素-UVA胶原交联，证实其可增加巩膜组织生物抗张力作用，但当UVA的照射参数为：能量密度4.2 mW·cm-2，照射时间30 min，总能量7.6 J·cm-2时，导致视网膜的光感受器细胞和色素上皮细胞严重受损，但将UVA的照射能量密度、照射时间和总能量改为3 mW·cm-2、30 min、5.4 J·cm-2时，取得了较好的加强巩膜强度的效果，有效且安全[1]。

根据本生-罗斯科互易律的规定，即在能量密度低于50 mW·cm-2、照射时间>2 min的照射都是有效的，若同时增加能量密度，减少照射的时间，且保证照射总能量相同，对兔角膜及巩膜的胶原交联应该是有效的[9]。Schumacher等[10]通过研究证明能量密度3 mW·cm-2、照射时间30 min的UVA得到的交联效果，与快速胶原交联9 mW·cm-2、10 min时的交联效果几乎是同等的。以往的研究也表明，5.4 J·cm-2能量的核黄素-UVA胶原交联可引起兔及人角膜硬度的增加[9-10]，而角膜和巩膜组织在相同能量密度下进行胶原交联，可发生相似的组织结构的改变[11]。因此，我们有理由相信照射总能量为5.4 J·cm-2的核黄素-UVA胶原交联可引起兔巩膜胶原纤维密度和直径的增加，而对眼内组织不造成损伤。为了证实这一点，本实验选用两种不同的照射方式对兔眼鼻上象限的巩膜组织进行了胶原交联实验，两组照射的总能量均为5.4 J·cm-2。另外，鉴于巩膜为瓷白色组织，UVA在巩膜的穿透性较角膜相对较弱，但由于巩膜对药物的渗透性较好，故本实验中提前5 min在照射区域滴加光敏剂核黄素溶液，以保证照射前待照射区域已经渗透足够的核黄素。

目前生物力学研究已由组织深入到细胞。以往研究表明，细胞的各项生命活动如生长、分化、调控、凋亡以及癌变等，都与细胞力学特性密切相关。而在近视的发展过程中，巩膜成纤维细胞作为组成巩膜的主要细胞，其细胞信号的转导和表达及其力学特性的改变对巩膜发生重塑具有重要影响，对近视的形成具有举足轻重的作用[12-14]。因此对细胞力学性能尤其是近视眼巩膜成纤维细胞的研究对于人们深入认识及改善细胞功能，具有十分重要的意义。近年来，在巩膜细胞力学方面的研究也逐渐深入。陈维毅等[15]用微管吸吮的方法结合半无限体细胞力学模型测定透镜诱导豚鼠对照组及实验组巩膜成纤维细胞的力学特性，发现实验组巩膜成纤维细胞的黏弹性参数明显升高。Chen等[16]用同样的方法与力学模型研究透镜诱导豚鼠不同诱导时间前部及后极部巩膜成纤维细胞的力学特性，LIM组前部及后极部巩膜成纤维细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数分别在诱导30 d和诱导15 d后有明显升高，即有“硬化”现象。Wang等[17]通过FX-4000力学加载系统对兔巩膜成纤维细胞进行力学环境中的培养，发现动态拉伸加载能增加巩膜成纤维细胞的增殖活性，同时能使各组巩膜成纤维细胞的生物力学特性发生改变。陈博宇等[18]将不同质量浓度的转化生长因子-β2(分别为0 mg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1)作用于后极部巩膜成纤维细胞24 h，利用细胞微管吸吮的方法测定各组巩膜成纤维细胞的力学特性，发现转化生长因子-β2能有效刺激基质金属蛋白酶2的表达。所有这些实验结果表明，巩膜成纤维细胞的力学特性改变必然会对其形态、结构和功能产生影响。这种变化反映了细胞骨架结构以及组成，伴随近视的发展和内部微力学环境的变化，而发生了相应的重组。