高白鲑肌肉蛋白质组双向电泳技术体系的优化

于亚文 朱新荣 张 建

（石河子大学食品学院 新疆石河子832000）

蛋白质组（Proteome）于1994年首次提出，定义为“由基因组所表达的全部蛋白质”[1]。近年来，蛋白质组学技术发展迅速，已成为生命科学研究中的重要领域。而双向电泳 （Two-dimensional electrophoresis，2-DE） 技术是目前蛋白质组研究技术的标准方法[2]。双向电泳的分辨率较高，近年来，在医学、农业和微生物学等研究领域广泛运用[3]。目前，国内对于双向电泳主要用于分离蛋白质以及后续蛋白质组学的研究。徐永杰等[4]研究了猪肌肉组织双向电泳分离条件的建立及常见问题；梁光明等[5]研究凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳分离技术的建立；王任等[6]建立大黄鱼肌肉组织双向凝胶电泳方法；丁勤学等[7]就双向电泳技术中样品上样方式及水化上样等做出讨论。目前关于高白鲑的研究，主要集中在营养养殖、贮藏保鲜等方面，基于双向凝胶电泳技术的高白鲑肌肉组织蛋白尚未见报道。

高白鲑属鲑科、白鲑属，为冷水性鱼类。营养全面，肌肉蛋白质含量平均为18.83%，氨基酸含量平均为17.48%，其中必需氨基酸含量为9.16%，占氨基酸总量的52.40%[8]，并且肉质鲜美，备受消费者喜爱，具有重要的经济和营养价值。同时由于其营养价值丰富，水分含量较高，易腐败变质。如贮藏不当，鱼肉的蛋白质、氨基酸等会分解变质，对鱼肉品质产生不利影响[9]。本研究以高白鲑为试验材料，通过对蛋白质样品的制备方法、上样量、IPG 胶条的pH 范围、等电聚焦程序、助凝剂剂量、SDS-PAGE 凝胶浓度及染色方法等因素的比较，优化双向电泳条件，建立适用于高白鲑肌肉蛋白质的双向电泳体系，获得分辨率高、横纹少等较理想的二维电泳图谱，为下一步开展高白鲑蛋白质组学的研究奠定基础，也为其它鱼类肌肉蛋白质组学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜活的高白鲑（1 000±50）g，新疆天润赛里木湖渔业开发有限公司。真空包装，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 试剂与设备

IPG 干胶条 （17 cm）、尿素 （Urea）、硫脲（Thiourea）、二硫苏糖醇（DTT）、3-[3-（胆酰氨丙基） 二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、Ampholine（pH 3～10 或pH 5～8）、碘乙酰胺（IAA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、溴酚蓝、低熔点琼脂糖、过硫酸铵（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris 碱、甘氨酸、牛血清白蛋白（BSA）等试剂，北京博奥拓达科技有限公司；其它试剂均使用国产分析纯级试剂。

DYY-16D 型 电 泳 仪、WD-9412A 恒 温 循 环器、DYC-DD2 等电聚焦电泳槽、DYC-SCZ8 垂直电泳槽、DYCX-C 型凝胶成像系统，北京六一生物科技有限公司；台式冷冻高速离心机、超低温冰箱，美国Thermo Scientific 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白样品的制备及定量 液氮研磨法：取高白鲑背脊部肌肉3～5 g，置于液氮中冰冻，研磨后精确称取0.05 mg 分装于1.5 mL EP 管中，添加500 μL 的 裂 解 液 （8 mol/L Urea，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，5%Ampholine，0.001%溴酚蓝） 裂解2 h，然后在低温（4 ℃）离心机中12 000 r/min 离心1 h，弃去上层悬浮及下层沉淀，取中间澄清液，即为提取的高白鲑组织蛋白样品。

丙酮沉淀法：取高白鲑背脊部肌肉2 g，加入6 mL 抽提液（3.00 g Urea，1.55 g 硫脲，15 μL β-巯基乙醇，用0.01 mol 磷酸盐缓冲液定容至10 mL）匀浆，于4 ℃冰箱放置14 h 后取出，以10 000 r/min，离心20 min，取上清液，向其加入10 倍体积的-20 ℃预冷的丙酮，于-20 ℃冰箱中静置2 h 后，10 000 r/min，离心10 min，保留沉淀，自然干燥30 min 使丙酮挥发，得到蛋白质团块。向蛋白质团块加入500 μL 裂解液，充分打散混匀，4 ℃，10 000 r/min，离心10 min，取上清液备用。

蛋白质定量采用Bradford 法，在波长595 nm条件下，用标准牛血清蛋白绘制标准曲线，对制备蛋白溶液定量，蛋白样品直接上样或分装后于-80℃保持备用。

1.3.2 上样量选择方法 17 cm pH 5～8 IPG 胶条上样量设定3 个对比：60，90，120 μg，进行双向电泳。

1.3.3 IPG 胶条pH 范围选择方法 IPG 胶条设定2 个对比，分别为17 cm pH 5～8 和17 cm pH 3～10，进行双向电泳。

1.3.4 聚焦时间 一向胶聚焦时间设定2 个对比：程序一，400 V 10 h+1 000 V 2 h；程序二，400 V 16 h+1 000 V 3 h，进行双向电泳。

1.3.5 平衡时间 胶条平衡时间设定2 个对比：5，15 min，进行双向电泳。等电聚焦完成后，取出胶条，用滤纸吸取表明多余液体，依次放入平衡缓冲液I （6 mol/L Urea，2%SDS，50 nmol/L pH 8.8 Tris-HCl，20%甘油，1%DTT）、平衡缓冲液II（2.5%碘乙酰胺代替平衡液I 中1%DTT）中，选择5，15 min 于摇床上平衡。

1.3.6 助凝剂剂量 配制二向胶溶液 （33%水，40%二向凝胶储备液，25% 1.5 mol/L pH 8.8 Tris碱，1%SDS（10%）混匀，取10 mL 装入100 mL 小烧杯中，分别加入如表1所示含10%过硫酸铵和TEMED），每隔1 min 检测二向胶是否凝结，并记录开始凝胶时间。

1.3.7 二向胶浓度的选择 二向胶浓度设定2 个对比，分别为10%和12%SDS 聚丙烯酰氨凝胶，配制试剂如表2。

表1 试剂添加量Table 1 Reagents of experiment

表2 不同浓度的凝胶试剂添加量Table 2 Reagents of different concentration in gels

1.3.8 凝胶染色、扫描及图谱分析 比较分析考马斯亮蓝染色和硝酸银染色效果。

考马斯亮蓝染色：用考马斯亮蓝染色液（0.12%考马斯亮蓝G-250，40%甲醇，10%冰醋酸）浸泡，摇床上过夜，染色完成后，用蒸馏水清洗2～3 次，再用脱色液（30%甲醇，10%冰醋酸）脱色，每1 h 换新脱色液浸泡脱色，3 次以上，直至图像清晰为止。

硝酸银染色：固定，加入固定液（10%冰醋酸，40%无水乙醇蒸馏水定容至500 mL），摇床上过夜，把经固定的胶板置于盛有500 mL 双蒸水的塑料盘中清洗3 次，每次10 min；致敏，将胶放入致敏液（0.2%硫代硫酸钠，6.8%乙酸钠，30%无水乙醇）中，摇床上浸泡30 min，用500 mL 蒸馏水在塑料盘中清洗3 次，每次10 min；染色，加入染色液（0.25%硝酸银），银染20 min，振荡混匀，注意避光，染色完成后，纯水洗2 次，每次1 min；显色，先用少量显色液（2%碳酸钠，0.8 mol/L 甲醛溶液）快速洗去“黄褐色泥沙样”的背景杂质，再加入多量显色液，快速振荡，密切观察染色情况，及时加入终止液（11.6 g/L EDTA），一般2～5 min 即可；终止显色，在终止液中放置30 min，用蒸馏水摇晃清洗10 min。

脱色后凝胶用Vilber Lourmat 凝胶成像系统扫描并进行图谱分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质样品制备方法对结果的影响

蛋白质样品制备是双向电泳的基础步骤，是影响结果的关键因素[10]。本试验采用液氮研磨和丙酮沉淀2 种方法进行蛋白质样品制备。结果显示利用液氮研磨法提取的蛋白质所得的2-DE 图谱（图1a）的蛋白点较少，分辨率低，蛋白质拖尾现象严重。丙酮沉淀法是蛋白质组学研究中常用的蛋白质提取方法，可有效对蛋白样本进行浓缩及除盐[11]，利用丙酮沉淀法所得的2-DE 图谱 （图1b）的蛋白点明显增多且清晰，拖尾现象减少。丙酮沉淀法有效去除了核酸、脂肪等杂质的影响，提取的蛋白质较纯，过夜放置使得蛋白质的提取率增加，所得图谱效果较佳。因此后续试验选用丙酮沉淀法进行蛋白质样品制备。

图1 不同蛋白质提取方法的2-DE 图谱Fig.1 The 2-DE map of different protein extraction methods

2.2 不同上样量的影响

胶条的蛋白上样量是决定双向电泳图谱质量的重要因素之一。本试验选用17 cm IPG 和考马斯亮蓝染色，对上样量进行分析。上样量过高使蛋白质不易分离，易造成图谱拖尾。而上样量过低时，低丰度的蛋白质点不易被染色，无法观察，从而可能丢失很多重要的蛋白质信息。提高蛋白质的上样量有利于低丰度蛋白质的检测，而上样量过高会引起双向电泳图谱的畸变，高丰度蛋白会掩盖其它蛋白点，致使双向电泳图谱质量下降[12]。结果显示当蛋白上样量为90 μg 时，图谱（图2b）蛋白点清晰，纵纹和横纹较少；上样量为60 μg时，部分低丰度蛋白没有被检测到而使总蛋白点较少；而上样量为120 μg 时，出现蛋白质点密集分离不开的现象，拖尾严重。对比分析可得，17 cm pH 5～8 IPG 胶条蛋白样品的最佳上样量为90 μg，所得的图谱质量较佳。

图2 不同上样量的2-DE 图谱Fig.2 The 2-DE map of different loading quantities

2.3 IPG 胶条pH 范围对结果的影响

选择合适的pH 梯度范围的IPG 胶条对提高双向电泳图谱的分辨率很重要[13]。本试验选取17 cm pH 3～10 和pH 5～8 的IPG 胶条。采用pH 3～10 的IPG 胶条时（图3a），拖尾现象严重，尤其是碱性末端。这可能与高白鲑肌肉蛋白质的种类有关，肌肉蛋白在碱性条件下分离不彻底或含量较高。由于胶条长度一定，pH 范围越大，分离的蛋白质范围越广，而不同pH 值的越难区分，从而导致电泳图谱出现拖尾现象。pH 5～8 的IPG 胶条（图3b）的图谱蛋白点较为清晰，而分离到的蛋白质较少，尤其是碱性蛋白质损失严重，图谱较清晰，纵纹及横纹少。因此，在选择IPG 胶条pH 范围时，要根据试验目的与研究的蛋白质种类选择，本研究选用pH 5～8 的IPG 胶条。

2.4 不同聚焦时间对结果的影响

17 cm 的IPG 胶条来说，聚焦时间选择400 V 16 h+1 000 V 2 h 较为适宜。

合理的等电聚焦程序是获得高质量及高分辨率图谱的基础，等电聚焦程序的选择直接影响图谱上的横纹及蛋白质点的拖尾现象[14]。本试验采用两种聚焦时间在其它条件一致的情况下进行双向电泳试验。结果显示，当聚焦时间为400 V 10 h+1 000 V 2 h 时（图4a），图谱的蛋白点分布较为集中，并且数量少，由于聚焦时间不足，蛋白质不能很好的在一向胶中分散开。采用聚焦时间为400 V 16 h+1 000 V 2 h 时（图4b），得到的图谱蛋白点分散较为均匀，清晰度提高。由此可得，对于

图3 不同pH IPG 胶条的2-DE 图谱Fig.3 The 2-DE map of different pH IPG strips

图4 不同聚焦时间的2-DE 图谱Fig.4 The 2-DE map of different time of electrophoresis

2.5 不同平衡时间对结果的影响

双向电泳操作过程中，一向胶中的蛋白转移到二向胶中需要经过平衡，平衡时间影响蛋白质的转移程度。胶条平衡过程有利于蛋白从第一向到第二向的转移，使蛋白质巯烷基化，防止在电泳过程中重新氧化，以确保在此过程中正常迁移。结果显示，平衡5 min 时（图5a），蛋白质从一向胶到二向胶的转移效果较差，在胶片上方出现蛋白质条带，严重拖尾；而平衡15 min 时（图5b），一向胶中蛋白质较好的转移到二向胶中，蛋白点较为清晰，横纵纹较少。胶条的平衡过程是双向电泳的关键步骤，对比分析可知平衡时间选择15 min 较为合理。

图5 不同平衡时间的2-DE 图谱Fig.5 The 2-DE map of different time of balance

2.6 凝胶剂剂量的选择

双向电泳操作中，凝胶剂TEMED 和过硫酸铵的用量直接影响胶片凝结时间。凝胶剂剂量的选择对试验的成功与否具有重要影响。凝胶剂的剂量过多，胶凝太过迅速，无法将胶灌注到胶板中；凝胶剂用量过少，胶无法按时凝结，胶片脆弱且不光滑，并且长时间等待会影响后续试验进程。由图6中可知，随着TEMED 和过硫酸铵用量的增加，胶凝结的时间明显缩短，变化显著。由灌胶所需时间所知，30 min 凝胶时间较为理想，从图6中可以看出，第5 组凝胶时间复合要求，即添加10%过硫酸铵0.05 mL，TEMED 2 μL。当然，不同温度也会对凝胶时间有影响，具体选择时，要根据环境因素以及试验所合适的凝胶时间选择。

图6 不同助凝剂剂量对凝胶时间的影响Fig.6 The influence to time of different concentration of assistant reagent

2.7 不同二向胶浓度的影响

SDS-PAGE 凝胶电泳主要根据蛋白质的相对分子质量进行分离[15]，不同样品蛋白质的相对分子质量不同，所选择的凝胶浓度也有差异，因此选择适宜的胶浓度以达到良好的分离效果。本试验采用10%和12%两种胶浓度进行对比，结果发现：高白鲑肌肉蛋白在10%浓度的二向胶图谱 （图7a）中分离效果较好，而浓度小的胶在低分子质量蛋白易跑出，并且胶浓度较低胶容易破碎，在操作大胶过程中较困难；而12%浓度的二向胶图谱（图7b）的分离效果要差于10%，横纵条纹相对较多，分离不彻底。因此在后续试验中第二向选择浓度为10%的凝胶。

2.8 不同染色方法的影响

染色方法对双向电泳图谱分辨率的高低以及蛋白点检测的灵敏度有很大影响[16]，最常用的检测方法有银染和考马斯亮蓝染色两种，此外还包括放射自显影和荧光染色等[17]。本试验用银染和考染两种染色方案对高白鲑肌肉组织总蛋白双向电泳结果进行分析，结果显示，银染（图8a）图谱中蛋白点多且较为清晰，灵敏度明显高于考染，而考染（图8b）图谱检测到蛋白点少，灵敏度低。对比分析，银染灵敏度显然高于考染，而操作相对复杂，干扰因素较多。考染操作简单，价格低廉，而蛋白点少且灵敏度低，不易出结果，因此后续研究中，在对比寻找差异蛋白点时可选用银染法制胶，而结合质谱进行差异蛋白鉴定时选用考染法。

图7 不同二向胶浓度的2-DE 图谱Fig.7 The 2-DE map of different concentration in gels

图8 不同染色方法的2-DE 图谱Fig.8 The 2-DE map of different staining methods

3 结论

蛋白质样品的制备是双向电泳技术最为关键的环节，根据样品自身的特性，选择最适合的制备方法。肌肉组织由于其特殊性，与其它样品的双向电泳略有不同。本研究采用两种方法进行蛋白质提取，对比电泳结果，丙酮沉淀法能很好的提纯蛋白质，该方法去除了核酸、脂肪等杂质的影响，提取的蛋白质较纯，使得蛋白质的提取率增加。生物体中大部分蛋白的等电点在pH 4～8 之间，通过对IPG 胶条pH 值选择的优化试验，可知线性宽范围的胶条（pH 3～10）其pH 值分布范围广，基本涵盖样品中所有等电点的蛋白，而大量蛋白点集中在胶条中间，得到的2-DE 图谱碱性端拖尾严重，蛋白点也较少，总体图谱质量差，而窄范围（pH 5～8）的胶条能够有效提高双向电泳图谱的分辨率和灵敏度，然而也会存在pH 梯度外蛋白丢失现象，因此，选择一个合适pH 梯度范围的IPG 胶条对提高2-DE 图谱质量有重要作用。合理的等电聚焦程序是获得高质量及高分辨率图谱的基础，等电聚焦程序的选择对图谱上的横纹及蛋白质点的拖尾直接影响。通过实验发现一向胶聚焦时间400 V 16 h 比较适宜，蛋白质分散均匀，有效改善图谱的横纹及拖尾问题，而选用平衡时间15 min可以使一向胶中的蛋白很好的转移到二向胶中。在用不同浓度的SDS-PAGE 胶进行第二向电泳时发现，10%的胶中蛋白质图形点数均匀，效果最佳。最终对比染色方法得到银染蛋白点多且效果优于考染。

综上所述，该研究建立的高白鲑肌肉蛋白质双向电泳体系：丙酮沉淀法制备蛋白质样品，选用90 μg 上样量，17 cm pH 5～8 的IPG 胶条，设定一向胶聚焦时间为400 V 16 h+1 000 V 2 h 以及平衡时间为15 min，助凝剂剂量选用过硫酸铵0.05 mL，TEMED 2 μL，采用浓度为10%的二向分离胶以及硝酸银染色。采用本试验方法得到的双向电泳图谱更为理想，蛋白点清晰，分布均匀，且具有比较好的重复性，这为后续蛋白质组学研究奠定了基础。