脱毒菜籽多肽大鼠降血压试验及机理研究

2019-08-07王禹程马海乐黄姗芬崔鹏飞李云亮

中国食品学报 2019年7期

王禹程马海乐杨雪黄姗芬崔鹏飞李云亮

（江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013）

高血压是常见慢性病之一，是一种以动脉血压持续升高为特征的心血管综合症，它是我国心脑血管病发病最主要的危险因素之一，控制高血压是预防心脑血管疾病的关键措施[1-3]。中国约有2.66 亿高血压患者，超过全球高血压总人数的五分之一，每年因心血管疾病死亡350 万人，占到死亡总数的41%[4-5]。目前治疗高血压主要通过药物治疗，常用的药物包括卡托普利、硝普钠[6-7]等，由于长期服用此类合成药物会产生晕眩、恶心、口干、腹痛等副作用，因此，利用天然食物制备安全无毒副作用的降血压产品成为食品研究领域的热点之一[8-9]。

菜籽饼粕是油菜榨油后的副产物，其中蛋白含量高达35%～42%，菜籽蛋白没有限制性氨基酸，生物效价和利用率都很高，然而菜籽中含有毒物质硫甙，导致菜籽蛋白一直得不到有效利用，随着脱毒技术的提高，脱毒菜籽蛋白中的硫甙含量大幅下降，可以达到安全使用范围。菜籽蛋白经酶解制备的菜籽多肽具有良好ACE 抑制功效[10-11]，而体外试验中菜籽多肽样品没有经过人体胃肠消化系统，其结果不能完全代表体内降压功效[12-13]，有必要进行系统的动物实验并探究作用机理。本文通过一次性灌胃和30 d 灌胃脱毒菜籽多肽试验，研究其对高血压模型鼠的降压功效、作用器官及其降压机理，为脱毒菜籽多肽降压产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 试验材料菜籽粕（蛋白含量37%），丹阳市正大油脂有限公司；卡托普利（Captopril，Cap）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG），美国Sigma 公司；复合蛋白酶，诺维信（中国）生物技术有限公司；科研试剂盒，南京建成顺浩生物科技有限公司；其余试剂为国产分析纯级。

1.1.2 试验设备 ALC-NIBP 无创血压测量分析系统，上海奥尔科特生物科技有限公司；多功能酶标仪Tecan Infinite PRO TWIN 200，上海迪奥生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 脱毒菜籽蛋白的提取参考刘大川等[14]的方法制备脱毒菜籽蛋白，经冷冻干燥获得脱毒菜籽蛋白粉末。

1.2.2 脱毒菜籽多肽的制备取脱毒菜籽蛋白粉末，使用固体复合蛋白酶，在固液比1∶20（g/mL）、酶底比1∶20 （g/g）、pH 7.5、50 ℃的条件下酶解2 h。于80 ℃热水浴中灭酶15 min，离心取上清液浓缩后，冷冻干燥得脱毒菜籽多肽粉末（蛋白含量70.3%）。

1.2.3 动物饲养 ICR 健康雄性小鼠体质量（20±2）g，许可证编号：SCXK（苏）2013-0011，动物试验室许可证编号：SYXK（苏）2013-0036，江苏大学提供。10 周龄雄性原发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR），体质量为（280±20） g，许可证编号：SCXK（沪）2012-0002，合格证编号：2015000527221，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。动物均于江苏大学实验动物中心屏障系统内饲养，温度保持（24±2） ℃，湿度保持50%±2%，昼夜各半。

1.2.4 毒理学试验最大耐受剂量法：40 只ICR小鼠分两组，每组20 只，两组分别按总剂量25 g/kg bw 灌胃脱毒菜籽多肽和脱毒菜籽蛋白，分3次进行，每次间隔6 h 以上。连续观察10 d，观察两组小鼠中毒症状及死亡情况。

1.2.5 大鼠分组和给药剂量适应性喂养一周，挑选收缩压大于180 mmHg 的大鼠随机分4 组，分别为阴性对照组卡托普利组（Cap，剂量30 mg/kg bw·d）、脱毒菜籽多肽组（Rpep，剂量2.5 g/kg bw·d）、脱毒菜籽蛋白组（Rpro，剂量2.5 g/kg bw·d）和对照组（Control，等体积水），每组12 只，一次性和30 d 灌胃实验各用6 只。

1.2.6 大鼠血压测定按剂量一次性灌胃各组对应受试物后使用ALC-NIBP 无创血压测量分析系统测定SHR 从灌胃0 h 到24 h 的收缩压（Systolic blood pressure，SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure，DBP）。30 d 灌胃实验开始后每7 d 测量一次大鼠SBP 和DBP，测定时间为当日灌胃之前。

1.2.7 组织ACE 提取组织ACE 的提取参考李云亮[15]的方法，略作修改。一次性灌胃实验在SHR大鼠灌胃6 h 后，30 d 灌胃实验在最后一次灌胃次日提取组织ACE。每只大鼠腹腔注射15%水合氯醛溶液1 mL 麻醉，通过下腔静脉放血法收集血液。分离主动脉、肺、心脏和肾脏组织，称重并计算脏器指数（脏器指数=脏器质量/体质量×100%）。剪碎这些组织并加入预冷缓冲溶液（50 mmol/L Tris-HCl，0.3 mol/L NaCl，0.5%Triton X-100，pH 7.9）（主动脉加液量为20 mL/g，肺和肾脏为4 mL/g，心脏为6 mL/g）进行均质，经离心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）取上清，即得能溶于表面活性剂Triton X-100 的ACE 部分。

1.2.8 ACE 酶活测定参考李云亮[15]的方法，FAPGG 作为ACE 的底物（血管紧张素I）模拟物，在340 nm 波长处有最大吸收峰，经ACE 水解后变成FAP 和GG，使得产物在340 nm 波长下吸光度下降，通过吸光度下降值可以计算出ACE 酶活性，样品加样体积和顺序见表1。

表1 ACE 酶活测定Table 1 Determination of ACE enzyme activity

酶活定义：37 ℃下，30 min 内催化水解1 μmol 底物FAPGG 所需ACE 酶量为1 U。1.2.9 血清指标测定负压真空采血管从大鼠腹腔静脉取血，室温静置1 h 自然凝固，平衡后离心（3 000 r/min，10 min，4 ℃），黄色透明上清即为血清。用试剂盒测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNFα）、内皮素（ET-1）、肾素（Renin）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（eNOS）、血管紧张素II（ANG II）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶同工酶（LDH-1）和谷胱甘肽-S 转移酶（GST）含量。

1.3 统计学分析

试验结果以SPSS 17.0 软件进行统计学分析，试验数据用±s 表示，采用Independent-samples T-test 检验，差异显著水平为P<0.05，差异极显著水平为P<0.01。

2 结果与分析

2.1 毒理学试验

两组小鼠按总剂量25 g/kg bw 分别灌胃脱毒菜籽蛋白和脱毒菜籽多肽。10 d 后，两组40 只小鼠没有死亡，均能自由活动，没有任何中毒症状出现。说明所制脱毒菜籽蛋白按总剂量25 g/kg bw灌胃对小鼠没有毒性，经复合蛋白酶酶解制备的脱毒菜籽多肽按总剂量25 g/kg bw 灌胃对小鼠同样没有毒性，两种样品最大耐受剂量均大于25 g/kg bw。

2.2 血压测定

2.2.1 一次性灌胃实验各组经一次性灌胃各受试物后，分别测定SHR 大鼠在灌胃后0，2，4，6，8，10，12，24 h 的SBP 和DBP，数据见图1和图2。SBP 指标中，4～10 h 间Rpep 组相比对照组极显著下降（P＜0.01）。Cap 组在4 h 时SBP 达到最大降幅26.4 mmHg，Rpep 组SBP 下降速度缓于Cap 组，在6 h 时SBP 达到最大降幅24.4 mmHg。10 h 时血压Cap 组的大鼠SBP 回升到最初水平，Rpep 组大鼠SBP 回升速率比Cap 组小，降血压效果从4 h 持续到12 h。DBP 指标中，Rpep 组从2 h 到6 h 的DBP 持续下降，6 h 时达到最大降幅18.3 mmHg，相比对照组差异显著（P＜0.05）。Cap 和Rpro 组相比对照组始终没有差异（P＞0.05）。

2.2.2 30d 灌胃实验各组经30 d 灌胃实验后，每7 d 测量一次大鼠的SBP 和DBP，数据见图3和图4。SBP 指标中，Cap 和Rpep 组SBP 下降趋势基本一致，在第2 周时达到最大降幅9.7 mmHg和12.2 mmHg，之后SBP 趋于稳定。Rpro 相比对照组没有差异（P＞0.05）。DBP 指标中，Cap 和Rpro组DBP 没有明显下降（P＞0.05），Rpep 相比对照组DBP 显著下降（P＜0.05），试验第4 周达到最大降幅13.3 mmHg。

Cap 组实验结果与有关卡托普利降血压功效的报道一致[6，16]。脱毒菜籽多肽能显著降低SBP 和DBP（P＜0.05），虽然起效速度不如卡托普利但作用效果维持时间长。目前研究表明即使血压的小幅下降也可以有效降低心血管疾病的发病率[18-19]，因此能长时间保持降压效果的降压产品值得关注，脱毒菜籽多肽是值得开发的良好降压产品。

图1 一次性灌胃实验大鼠收缩压变化Fig.1 Changes of SBP in rats in single gavaged test

图2 一次性灌胃实验大鼠舒张压变化Fig.2 Changes of DBP in rats in single gavaged test

图3 30 d 灌胃实验大鼠收缩压变化Fig.3 Changes of SBP in rats in 30 days gavaged test

图4 30 d 灌胃实验大鼠舒张压变化Fig.4 Changes of DBP in rats in 30 days gavaged test

2.3 ACE 酶活测定

一次性灌胃和30 d 灌胃后从SHR 大鼠肺、肾、心脏和动脉中提取ACE 酶并测定ACE 酶活，结果见表2。两次试验结果相近，相比各对照组，Cap 组肺和动脉中酶活都有极显著下降（P<0.01），肾显著下降（P<0.05）。而两个试验的Rpep 组大鼠仅肺、肾和动脉中酶活水平显著下降（P<0.05），Rpro 组大鼠肺和动脉中ACE 酶活与各自对照组相比均没有显著差异（P>0.05）。两个试验中各组大鼠心脏ACE 酶活之间均没有显著差异（P>0.05）。脱毒菜籽多肽在肺、肾和动脉中抑制ACE 酶活作用效果明显，而在心脏中效果不明显。一次性灌胃脱毒菜籽多肽在动脉中ACE 抑制率最高为27.5%，在肺和肾中分别仅有7.7%和12.1%，经30 d 灌胃脱毒菜籽多肽动脉中ACE 抑制率最高为20.5%，在肺中上升到11.5%，在肾中下降到7.9%。ACE 酶在人体肾素-血管紧张素系统（Reninalangiotension system，RAS）和激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-kinin system，KKS）中发挥重要作用，它能够催化血管紧张素I 生成血管紧张素II引起血压升高[17]。在动脉、肺和肾中抑制ACE 酶活是脱毒菜籽多肽降压的一条途径。

表2 大鼠脏器中ACE 酶活测定Table 2 Determination of ACE enzyme activity in rat organs

2.4 脏器指数

各组经过灌胃之后，解剖称取各组SHR 大鼠的肺、肾、心脏、肝、脾和胃并计算脏器指数，具体数据见表3。从结果中发现对照组、Cap 组、Rpep组和Rpro 组在肺、肾、心脏、肝、脾和胃的脏器指数上均没有显著性差异（P>0.05），说明试验所制脱毒菜籽多肽和脱毒菜籽蛋白样品对SHR 大鼠各脏器没有明显影响。

表3 脱毒菜籽多肽对大鼠脏器指数的影响Table 3 Effects of detoxic rapeseed peptides on organ index in rats

2.5 血清指标测定

两次灌胃实验大鼠血清中各项指标含量用科研试剂盒测定，数据见表4和表5。

TNF-α 与机体炎症反应的关系密切，细胞受到损伤时会激活TNF-α 诱导细胞炎症反应，炎症反应会影响动物血压，还会引起ET-1，NO，eNOS等血清指标含量变化[18-19]。两次灌胃实验中对照、Cap、Rpep 和Rpro 4 个组大鼠血清中TNF-α 含量没有差异（P>0.05）。实验说明所制脱毒菜籽蛋白和脱毒菜籽多肽不含炎症因子，不会引起机体炎症反应，不会对血压及其它血清指标含量产生影响。

一次性灌胃实验中，对照、Cap、Rpep 和Rpro 4 组在ET-1 和Renin 含量指标上没有差异（P>0.05），30 d灌胃实验中Rpep 组ET-1 和Renin含量均极显著下降（P<0.01）。而Rpep 组的ANGII含量在前、后两次灌胃实验中均显著下降（P<0.05），降幅分别为10.7%和9.7%。内皮素具有非常强烈的收缩血管的生物活性，目前研究发现3种内皮素亚型（ET-1，ET-2，ET-3），以ET-1 的作用最强[20]。肾素-血管紧张素系统是升压系统，在肾素作用下，血管紧张素原转化为血管紧张素I，经ACE 酶酶解转化为血管紧张素II。肾素和血管紧张素II 在肾素-血管紧张素系统中有举足轻重的作用。一次性灌胃实验中，ET-1、Renin 和ANGII 3 个指标里只有ANGII 显著下降（P<0.05），30 d 灌胃实验中3 个指标均显著下降（P<0.05）。说明脱毒菜籽多肽可以通过降低ET-1、Renin 和ANGII 含量起到降血压的作用。一次性灌胃实验由于作用时间短，脱毒菜籽多肽只能影响Renin到ANG II 作用途径上的某种物质，据文献报道推测应该是ACE 酶[21-22]，其酶活被抑制了。

一次性灌胃实验中，Rpep 组NO 和eNOS 含量最高，分别为（4.76±0.15）ng/mL 和（34.85±0.97）μIU/L，与对照组相比均有极显著性上升（P<0.01），Rpep 组NO 含量显著高于Cap 组（P<0.05）。30 d灌胃实验中Rpep 组NO 含量相比对照组极显著提高16.7%（P<0.01），eNOS 含量与对照组无显著差异（P>0.05）。NO 是强效的内源性血管舒张因子，eNOS 则为内皮型一氧化氮合成酶（NOS），是其主要3种亚型（nNOS，eNOS，iNOS）之一[23]，eNOS 可以促进NO 的合成。试验说明脱毒菜籽多肽的降血压活性除了通过抑制ACE 活性，还能通过提高NO 和eNOS 含量实现，一次性灌胃时效果显著好于卡托普利（P<0.05）。

一次性灌胃实验中，对照、Cap、Rpep 和Rpro组间的CK-MB、LDH-1 和GST 含量均没有显著差异（P>0.05），但30 d 灌胃实验中Cap 组的CKMB 和GST 含量均有显著提高（P<0.05），而Rpep和Rpro 与对照组间没有显著差异（P>0.05）。CKMB、天门冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶（LDH）等在心肌损伤或者坏死后有不同程度的增高，以CK-MB、LDH-1 的特异性最高[24]。谷胱甘肽S-转移酶（GST）主要存在于肝脏内，常在生物体受到诸如杀虫剂、化学致癌剂、紫外辐射、极端温度等伤害时发挥其抗氧化及解毒功能，机体受到损伤时GST 迅速释放入血导致血清GST 活性升高，因此GST 活性反应了肝脏和机体受到的化学损伤程度[25]。试验说明一次性灌胃各受试物不至于引起CK-MB、LDH-1、GST 含量的显著变化，而30 d灌胃实验中卡托普利表现某种毒副作用，会引起机体CK-MB 和GST 含量上升，而脱毒菜籽多肽没有表现出明显的毒副作用。