莲子低聚糖各单体体外益生效果研究

2019-08-07郑志昌陈映彤郭娟娟郑宝东

中国食品学报 2019年7期

郑志昌陈映彤郭娟娟徐晖郑宝东卢旭

（福建农林大学食品科学学院福州350002）

以非消化性碳水化合物为底物的糖化发酵和以非消化性蛋白质为底物的致腐性发酵是大肠微生物在上消化道代谢生存的两种基本方式。有研究表明，益生菌及剩余大肠微生物与非消化性碳水化合物间存在构效关系，并非所有菌株都能等效地利用同一碳源，不同微生物对碳源的利用情况也存在显著差异，这与菌群之间的糖苷水解酶差异，以及碳水化合物结构特征息息相关[1-4]。非消化性低聚糖以及某些长链多糖为膳食益生元，它们通过选择性促进肠道内有益菌增Px 的活力越高，呈现一定的量效殖，产生短链脂肪酸，降低肠道pH 环境或作为肠道细胞的营养物质，对宿主产生有益影响[5-8]。目前，膳食性益生元被认为是除抗生素和益生菌外，有效调节肠道菌群的天然膳食性成分。以酶法转化或化学方法合成的低聚果糖（FOS）、反式低聚半乳糖（t-GOS）以及抗性淀粉（RS）等膳食纤维的益生功效已被广泛认可。作为自然界构成和种类最复杂多样的结构性物质，许多来源于植物或大型真菌的天然碳水化合物普遍被证实具有潜在的益生元功能[9-11]。由于结构新颖，同分异构体广泛存在，所以纯化后不同组分的益生效果的构效关系有待进一步研究确定。

莲子是中国传统药食两用之佳品，含有丰富的碳水化合物成分，其直链淀粉含量高达40%，属于高直链特异性淀粉[12]。此外，还含有其它天然非淀粉类多糖、低聚糖等碳水化合物。莲子中新发现的新型低聚糖主要包括2 种三糖及1 种四糖，由甘露糖、果糖或葡萄糖通过α-1，6 或α-1，2 糖苷键相连，三者能协同促进双歧杆菌和乳杆菌增殖和产生短链脂肪酸，而对于每种低聚糖单体的具体增菌效能未做深入研究[13-15]。益生指数（PI）是比较膳食低聚糖益生效应的定量分析指标之一[16]，可有效评估肠道菌群发酵过程中若干关键菌群相对数量的变化情况。本文通过小鼠肠道菌群体外发酵研究，比较3 种莲子低聚糖（LOS）单体的益生效果差异，为莲子低聚糖的构效关系研究以及莲子资源的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲子低聚糖单体（LOS3-1：Man-1→6-Glc-1→2-Fru、LOS3-2：Man-1→6-Man-1→6-Glc，化合物4 为LOS4：Man-1→6-Man-1→6-Glc-1→2-Fru），采用中压制备型制备色谱法制备，方法参照Lu 等[15]的方法。速冻鲜莲，绿田（福建）食品有限公司。

低聚果糖，索莱宝科技有限公司；葡萄糖，国药试剂厂；SPF 级雄性BALB/C 小鼠，上海斯莱克实验动物有限公司（合格证编号：SCXK（沪）2012-002）；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸标准品，Aladin 试剂（上海）有限公司；选择性培养基，青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Puri Flash-150 型制备色谱仪，法国Interchim公司；PHS-3C 型精密pH 计，上海精密科学仪器有限公司；7890 型气相色谱仪，美国Agilent 公司；T6 新世纪紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；厌氧产气袋、厌氧培养盒，日本三菱公司；QL-866 型旋涡混匀器，江苏海门其利贝尔仪器制造有限公司；AL104 型精密分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SYQ-DSX-280B 型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SPX型生化培养箱，宁波江南仪器厂；恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 试验培养基

营养肉汤基础培养基（GAM）：动物组织胃蛋白酶消化物10 g；大豆蛋白胨3 g；酪蛋白胨10 g；消化血清粉13.5 g；酵母浸膏5 g；牛肉膏2.2 g；牛肝粉1.2 g；葡萄糖3 g；KH2PO42.5 g；NaCl 3 g；可溶性淀粉5 g；L-半胱氨酸盐酸盐0.3 g；硫基乙酸钠0.3 g；蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH 7.2～7.4，121 ℃高压灭菌15 min。

1.4 肠道菌群体外发酵

试验小鼠饲养于福建医科大学实验动物中心（设施使用许可证号：SYXK（闽）2012-0001），取适应期结束后的新鲜小鼠粪便约0.5 g，用20 mL 无菌PBS（0.1 mol/L pH 7.4）充分混匀作为肠道全菌群模板。以GAM 为基础培养基，添加5 mg/mL的莲子低聚糖单体为碳源配制试验培养基，以添加等量的葡萄糖（Glc）和低聚果糖（FOS）分别作为阴性对照和阳性对照。每组试验分装20 mL GAM培养基，各培养基初始pH 值用0.1 mol/L 的无菌NaOH 溶液将培养基调至pH 7.3±0.1，取小鼠新鲜粪便上清液0.5 mL 接入各培养基中，37 ℃气浴摇床厌氧发酵，于0，6，12，18，24，36 h 分别取样测定。

1.4.1 发酵液pH 值及菌体密度测定取特定时间点的发酵液，旋涡混匀器充分混匀5 s 后，以紫外-可见分光光度计检测OD 值，检测波长：600 nm。剩余菌液以8 000 r/min 离心5 min 后取上清液，采用精密pH 计测定发酵液pH 值。

1.4.2 发酵液短链脂肪酸（SCFAs）含量测定参考耿梅梅等[17]的方法，略有修改。准确移取2 mL上清液，加入0.5 mL 25%偏磷酸溶液，冰浴处理3 h，再次离心后经0.45 μm 滤膜过滤后进行气相色谱分析。色谱条件：HP-INNOWAX 色谱柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；起始温度：100 ℃，保持0.5 min，再以4 ℃/min 的升温速度加热至160 ℃，总过程运行16.5 min。进样量0.2 μL，载气为氮气，流速20 mL/min；燃气氢气流速30 mL/min，助燃气空气流速300 mL/min，尾吹氮气流量19 mL/min；FID 检测器温度240 ℃，进样口温度240 ℃；采用不分流的方式。

1.4.3 发酵液NH3含量测定参考Broderick 等[18]的方法，略有修改。准确移取1 mL 上清液，加入0.5 mL 25%偏磷酸溶液，冰浴静置30 min。吸取40 μL 样品溶液于10 mL 试管，依次加入等量去离子水及2.5 mL 苯酚显色剂，旋涡混匀后，再加入2 mL 次氯酸盐试剂，混匀后37 ℃水浴10 min，于550 nm 下测定吸光度值。

1.4.4 益生指数取发酵液100 μL 于15 mL 无菌离心管，用无菌PBS（pH=7.4，0.1 mol/L）溶液稀释至合适的稀释度，分别检测双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、大肠杆菌以及细菌总数，每个稀释度做3个平行样。结果以平均值±标准差（±s）表示，单位为：lg CFU/mL。益生指数（PI）的计算公式如下：

PI =（Bif/Toal） -（Bac/Toal） +（Lac/Toal） -（E.Coli/Toal）

式中，Bif，Bac，Lac，E.Coli，Toal——发酵液中特定时间点的双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、大肠杆菌以及细菌总数与其在粪便中原始数量的比值。

表1 培养基类型及其培养条件Table 1 The culture medium and conditions of different bacteria

1.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 发酵液pH 值变化

肠道菌群发酵液的pH 值与细菌代谢物中的短链脂肪酸-无机氮化合物间的比例相关。测定添加不同碳源的小鼠肠道菌群发酵液的pH 值结果如图1所示。在最初的12 h 内，各组发酵液的pH值均迅速下降，其中以莲子低聚糖为碳源的发酵液pH 值下降幅度最大，FOS 组次之，而Glc 组的下降幅度最小。12 h 后，FOS 组发酵液的pH 值继续呈缓慢下降的趋势，而其余各组则处于波动状态。

非消化性碳水化合物能够被双歧杆菌优先利用，其本质原因在于双歧杆菌等益生菌的基因组中含有更多与非消化性碳水化合物代谢相关酶类的基因片段[19]。添加莲子低聚糖单体及FOS 发酵液pH 值下降更加显著的原因可能在于通过促进益生菌的增殖，增加短链脂肪酸产量，同时限制致腐微生物的发酵作用，减少无机氮化合物的生成。而FOS 相比莲子低聚糖其发酵液pH 下降相对缓慢的原因可能与其聚合度较大，降解速度较慢有关。

2.2 发酵液菌体密度变化

发酵液的菌体密度可定性反映小鼠肠道菌群在不同碳源中生长情况。如图2所示，以Glc 为碳源的发酵液，菌体密度值上升速度最快，上升持续时间也最长，达到18 h；这与Glc 可作为肠道菌群发酵的共同碳源优先被利用并供菌体生长繁殖有关，进而造成菌体密度提高。在0～12 h 内，以莲子低聚糖和FOS 为碳源的发酵液菌体密度值没有显著性差异（P＞0.05）；LOS3-2、LOS4 及FOS 组的菌体密度在12～24 h 之间呈先下降后上升的趋势，提示该段时间内发酵液的细菌群落组成可能发生更替。在24～36 h 时期，各组发酵液的OD600值几乎保持不变，导致菌体密度不再上升的原因可能是体系的营养供应及细菌代谢物积累所致。

图1 莲子低聚糖对发酵液pH 值的影响Fig.1 Effect of LOS on pH value of broth

图2 莲子低聚糖对发酵液菌体密度的影响Fig.2 Effect of LOS on cell density of broth

2.3 发酵液SCFAs 含量

短链脂肪酸也被称之为挥发性脂肪酸（VFAs），是肠道菌群发酵碳水化合物的最终产物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。通过测定发酵液中主要短链脂肪酸的含量，比较不同莲子低聚糖的产酸量差异。结果如图3所示。

发酵液中的短链脂肪酸以乙酸为主，乙酸和丙酸浓度随发酵时间延长呈波动上升趋势，LOS及FOS 均可提高发酵液中的乙酸含量；除LOS3-1 外，LOS3-2，LOS4 以及FOS 对丙酸的产生均没有明显的促进作用。发酵液中丁酸和异丁酸含量在6～12 h 内快速上升，随着发酵时间延长，二者均不断下降；3 种LOS 均可不同程度地增加丁酸转化量。

乙酸、丙酸和丁酸是人和其它哺乳动物肠道中丰度最高的3 种短直链脂肪酸，约占总短链脂肪酸的90%～95%，它们源于肠道菌群对非消化性碳水化合物的发酵作用。而异丁酸与异戊酸等短支链脂肪酸通常源于致腐微生物对蛋白质的发酵作用。短直链脂肪酸具有塑造肠道环境、作为宿主细胞和肠道微生物的能量，以及参与不同的信号通路等特殊生理效应，短链直链脂肪酸也因此被认为是益生元发挥健康效应的基础。在庞大的肠道微生态系统中，不同微生物群体之间存在底物互生与代谢物互生现象[20]，基于这种现象，部分微生物可以在原本无法生长的基质中间接以底物降解物或代谢物作为碳源或能源。有报道指出[21-22]，双歧杆菌发酵低聚果糖产生的乙酸可被罗氏菌、真杆菌等间接利用。发酵液中的丁酸含量随发酵时间延长逐渐下降的原因可能是作为能源物质被一些非丁酸产生菌所消耗导致。

图3 莲子低聚糖对发酵液中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸含量的影响Fig.3 Effect of LOS on acetic acid，propionic acid，butyric acid and isobutyric acid levels

2.4 发酵液NH3 含量变化

通过测定以莲子低聚糖为碳源的肠道菌群发酵液中的NH3水平，比较不同莲子低聚糖对蛋白质发酵作用影响的差异性，结果如图4所示。在最初的12 h 内，各组发酵液中的NH3含量均迅速增加；12 h 后，以Glc 为碳源的发酵液中的NH3持续缓慢增加，而添加莲子低聚糖或低聚果糖的发酵液中NH3含量基本保持不变。NH3是一种潜在的有毒代谢产物，源于肠道微生物对蛋白质的发酵作用。添加莲子低聚糖可显著降低发酵过程中NH3的产生，说明莲子低聚糖可抑制肠道微生物对培养基中蛋白质的发酵作用，且不同碳源对蛋白质发酵的抑制作用依次为：LOS4>LOS3-2>LOS3-1>FOS>Glc。

2.5 益生指数

图4 莲子低聚糖对发酵液NH3 含量的影响Fig.4 The effect of LOS on ammonia level of broth

通过选择性培养基定量测定发酵液中特定菌群的数量变化，结果如表2所示。体外发酵12 h后，4 种待测菌群的数量均迅速增加；与Glc 组相比，以LOS3-2 和LOS4 为碳源的发酵液中，双歧杆菌和乳杆菌数量显著增加（P<0.05）；LOS4 和FOS 能显著减少拟杆菌的数量，FOS 不容易被大肠杆菌所利用。发酵24 h 后，各组培养基的特定菌群数量呈此消彼长的趋势；与12 h 相比，各培养基的双歧杆菌、乳杆菌数量基本呈下降趋势；拟杆菌和大肠杆菌逐渐增加。以LOS3-2、LOS4 及FOS 为碳源的发酵液，双歧杆菌和乳杆菌数量显著高于Glc 组，而拟杆菌和大肠杆菌数量则显著下降（P<0.05）。发酵过程中，各发酵液的细菌总数没有显著性差异（P>0.05）。

表2 不同碳源发酵过程中小鼠肠道特定菌群数量的变化（lg CFU/mL，±s）Table 2 Effect of different carbon source on the number of special intestinal flora in mice （lg CFU/mL，±s）

注：同列肩标* 表示12 h 时与Glc 组相比差异显著（P<0.05）；同列肩标# 表示24 h 时与Glc 组相比差异显著（P<0.05）。

益生指数是比较膳食益生元益生效果的量化指标，本文以大肠杆菌代替原始公式中的梭状芽胞杆菌[13]，通过测定小鼠肠道菌群发酵液中特定菌群及其与原始菌群数量的比例变化关系，以双歧杆菌和乳杆菌为阳性变化值（正值）；拟杆菌和大肠杆菌为阴性变化值（负值），获得小鼠肠道菌群发酵不同碳源的益生指数，结果如图5所示。

添加各碳源的培养基接种小鼠肠道菌群12 h 后，各发酵液的益生指数从高到低依次为：LOS4>LOS3-2>FOS>LOS3-1>Glc；其中LOS3-2、LOS4 的益生指数极显著高于Glc 及LOS3-1 组（P<0.01）。而24 h 各组的益生指数则为：FOS>LOS3-2>LOS4>LOS3-1>Glc，与Glc 组相比，LOS3-2、LOS4 及FOS 组的益生指数同样显著提高（P<0.05），而3 种莲子低聚糖之间没有显著性差异，且与12 h 相比，各组的益生指数均有不同程度下降。该结果与秦雪梅等[23]研究FOS、低聚半乳糖（GOS）以及聚葡萄糖（POL）对婴儿肠道菌群的益生作用基本一致。有国外研究者发现，果胶与果胶低聚糖（POS）的益生指数与其甲基化程度及阿拉伯糖含量有关[24-25]，且分子质量相对较小的POS 益生指数高于大分子质量的果胶。由此推测，分子质量相对较低的碳水化合物更适合作为肠道益生菌的发酵底物，从而表现出较高的益生指数。