淫羊藿苷对兔骨质疏松的疗效及骨组织MEG3、H19和DANCR表达的影响

张 峰,徐 瑞

(济宁医学院附属医院创伤外科,济宁 272100;*通讯作者,E-mail:zhangjiale99@tom.com)

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通过调控转录、转录后翻译以及表观遗传学水平来参与疾病的发生和发展[1,2]。MEG3作为一种长链非编码RNA,在调控骨髓间充质干细胞的分化过程中起重要作用,与骨髓间充质干细胞(BMSC)的异常分化密切相关[2,3],长链非编码RNA H19和DANCR可调节成骨细胞的增殖和分化[4,5]。体外实验已证实这三种长链非编码RNA对成骨细胞有调节作用,但是其与绝经期后形成的骨质疏松的关系尚无研究。淫羊藿苷是一种从天然植物中提取的黄酮类药物,已被证明有促进成骨与抑制破骨的双重作用,但其具体如何影响骨质疏松尚无明确结论。因此,本文研究淫羊藿苷对兔骨质疏松的疗效及骨组织中MEG3、H19和DANCR表达的影响,旨在为临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

淫羊藿苷购于南京泽朗医药科技有限公司(生产批号:20180901);1072型micro-CT购于比利时SkyScan公司,qRT-PCR检测试剂盒购于美国Invitrogen公司;鼠抗兔BMP-2多克隆抗体购于英国Abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆抗体购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 构建兔骨质疏松模型及药物干预

48只3月龄雌性新西兰白兔,(1.6±0.29)kg,按随机数字法分成实验组、模型组和假手术组,每组16只。2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,假手术组实施假手术切除卵巢周围脂肪一块,模型组与实验组行双侧卵巢切除术,切口长约3-4 cm,结扎卵巢血管,切除双侧卵巢及附着韧带,可吸收线按顺序缝合肌肉层、筋膜和皮肤。术后需每日观察动物的切口愈合情况。术后1周对实验组进行淫羊藿苷灌胃给药,每天剂量为20 mg/kg,假手术组与模型组每天灌胃生理盐水20 mg/kg,治疗时间8周。

1.3 标本取材与处理

药物干预8周,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉,采用快速心脏急性大失血法处死兔,逐层剥离腰椎、双侧股骨及颅骨,剔除周围软组织,以无菌生理盐水湿纱布包裹。70%乙醇固定股骨24 h行micro-CT扫描;取部分骨组织置于液氮中冻存备用,以行qRT-PCR检测;另留取椎体、股骨、颅骨10%甲醛溶液固定,10%EDTA 6周,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,制成石蜡切片,60 ℃烤箱4 h,保存备用。

1.4 Micro-CT观察骨质疏松显微结构和检测骨参数指标

取出固定股骨组织进行micro-CT扫描,电压100 kV,电流为98 mA,扫描过程中需将样本密封在塑料包里以避免在扫描过程中出现移动或样品脱水,获取图像。对图像进行阈值分割以从背景图像中分割出骨的图像,通过配套的3D软件将2D图像通过3D渲染获得3D模型,微CT图像分辨率为18.2 μm,根据三维图像对股骨标本的骨参数进行分析。

1.5 qRT-PCR检测骨组织mRNA表达水平

取出各组骨组织,严格按照试剂盒说明书操作,Trizol提取组织的总RNA,并用特异性的LncRNA反转录试剂盒进行逆转录,PCR扩增使用实时定量PCR预混合溶液SYBR Green qPCR Master Mix,参照qRT-PCR扩增引物序列,实验结果采用2-ΔΔCt法计算,以GAPDH作为内源参照基因(见表1)。

表1 qRT-PCR扩增引物序列

Table 1 qRT-PCR amplification primer sequence

基因 引物序列(5′-3′)MEG3前向:CTGCCCATCTACACCTCACG反向:CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGLnc-H19前向:GCACTGTATGCCCTAACCG反向:ATCCCTCCCTCCAACCCATDANCR前向:GCGCCACTATGTAGCGGGTT反向:TCAATGGCTTGTGCCTGTAGRunx2前向:ATGATGACACTGCCACCTCT反向:GGGATGAAATGCTTGGGAACGAPDH前向:TCACGGCAAATTCAACGGCACAGTCAAG反向:CAGCACCAGTGGATGCAGGGATGATGTT

1.6 免疫组化检测骨组织BMP-2蛋白表达

取出石蜡切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,流水反复冲洗,甲醇过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性,Tris缓冲液冲洗3次,每次10 min,4 ℃下鼠抗兔BMP-2多克隆抗体(1 ∶100)孵育过夜。Tris缓冲液冲洗3次,每次10 min,兔抗人GAPDH多克隆抗体(1 ∶200)室温孵育2 h,二氨基联苯胺DAB显色,光学显微镜观察并采集图片,采用Image-Pro-Plus图像分析软件分析,用平均积分光密度值(Integral Optical density,IOD)表示。依据染色分数评分和阳性细胞率评分评定结果。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 骨质疏松显微结构和骨参数指标

实验组和模型组BV/TV、Tb·Th和Tb·N较假手术组均显著下降(P<0.05),实验组BV/TV、Tb·Th和Tb·N较模型组均明显上升(P<0.05);实验组和模型组BS/BV和Tb·Sp较假手术组均显著上升(P<0.05),实验组BS/BV和Tb·Sp较模型组均显著下降(P<0.05,见图1、表2)。

图1 股骨3D图像Figure 1 The 3D image of femur

组别nBV/TV(%)BS/BV(%)Tb·Sp(mm)Tb·Th(mm)Tb·N(1/mm)假手术组161.03±0.125.84±0.470.05±0.020.49±0.072.45±0.44模型组 160.43±0.13∗16.25±1.37∗0.41±0.05∗0.23±0.08∗0.95±0.24∗实验组 160.61±0.11∗#11.25±1.89∗#0.26±0.03∗#0.31±0.06∗#1.34±0.04∗#

与假手术组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05

2.2 骨组织mRNA表达水平

实验组、模型组股骨和椎骨MEG3、Lnc-H19、DANCR和Runx2的mRNA水平较假手术组均明显下降(P<0.05),实验组股骨和椎骨MEG3、Lnc-H19、DANCR和Runx2的mRNA水平较模型组均明显上调(P<0.05)。实验组和模型组颅骨DANCR、Lnc-H19和Runx2的mRNA水平较假手术组均明显下调(P<0.05),实验组DANCR和Runx2的mRNA水平高于模型组(P<0.05),实验组Lnc-H19 mRNA水平低于模型组(P<0.05);三组MEG3水平无明显差异(P>0.05,见表2)。

2.3 骨组织BMP-2蛋白表达

BMP-2表达定位于股骨成骨细胞胞质,阳性反应呈黄色或棕黄色(见图2)。依据免疫反应评分得出假手术组、模型组、实验组BMP-2表达分别为5.81±0.43,3.40±0.35,4.51±0.32。模型组和实验组BMP-2蛋白表达较假手术组显著降低(P<0.05),实验组BMP-2蛋白表达较模型组增高(P<0.05)。

分组n指标假手术组 模型组 实验组 股骨16MEG31.05±0.090.63±0.08∗0.87±0.11∗#Lnc-H191.31±0.070.49±0.04∗0.71±0.06∗#DANCR1.14±0.080.59±0.05∗0.88±0.09∗#Runx21.58±0.080.91±0.16∗1.21±0.14∗#椎骨16MEG30.49±0.050.25±0.07∗0.41±0.4∗#Lnc-H190.99±0.110.87±0.09∗0.93±0.12∗#DANCR0.97±0.050.63±0.12∗0.84±0.10∗#Runx20.86±0.140.47±0.13∗0.61±0.12∗#颅骨16MEG30.29±0.090.31±0.080.27±0.11Lnc-H190.58±0.080.51±0.07∗0.46±0.06∗#DANCR0.35±0.050.16±0.02∗0.21±0.03∗#Runx20.63±0.090.34±0.04∗0.44±0.09∗#

与假手术组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05

3 讨论

淫羊藿苷是淫羊藿中含量最丰富的一种黄酮类成分,具有良好的骨再生和修复作用,越来越多的证据表明,淫羊藿苷既可以刺激骨形成,又可以抑制骨吸收,在骨转化的动态平衡中发挥重要作用[6,7]。淫羊藿苷的药物结构稳定,可以加载在生物材料上,从而形成局部的骨诱导[8,9]。因此,天然植物中提取的的淫羊藿苷成为了防治骨质疏松症的一种潜在药物。LncRNA是一种长度≥200个核糖核酸的非编码RNA,最新的研究表明,它在多种生物学过程中起着重要作用,如转录调控、细胞生长和肿瘤发生等[10]。既往的研究大多关注于骨质疏松治疗药物对mRNA的影响,但是尚无药物对lncRNA影响的研究,所以本研究主要探讨在用淫羊藿苷对骨质疏松治疗的过程中相关lncRNA的变化情况。

图2 免疫组化检测股各组骨BMP-2蛋白表达 (×200)Figure 2 Immunohistochemical detection of bone BMP-2 protein expression in each group (×200)

研究表明,在绝经期后,MEG3在骨髓间充质干细胞中的表达和miR-133a-3p的表达呈正相关,并且MEG3可以通过靶向调控miR-133a-3p的表达从而抑制成骨分化[11-13]。长链非编码RNA H19仅从母系遗传,不编码蛋白质。在进化过程中其高度保守,并且外显子的突变率很低,这些特征就决定了其生物学功能的重要性。研究证实,H19是成骨细胞增殖和分化的关键调节因子之一[4,14],其可能与骨相关疾病有关。此外,研究发现DANCR可通过诱导IL-6和TNF-α的表达促进骨的吸收,其可作为绝经后骨质疏松症的生物标志物[5]。DANCR还可调节成骨细胞的分化,是成骨细胞分化的重要介质[15]。

因而本文探究淫羊藿苷治疗兔骨质疏松对这三种非编码RNA在股骨、腰椎(L5)和颅骨中的表达影响。本文研究结果显示,治疗后,股骨中H19表达上调,与Li等[16]研究结果一致。淫羊藿苷干预后,兔骨质疏松模型中RUNX2表达升高。Bustamante等[17]在821名西班牙绝经期妇女的研究中发现,RUNX2与腰椎和股骨颈的骨密度有关。进一步比较免疫组化,结果显示淫羊藿苷治疗后BMP2在股骨颈中的表达明显上升,进一步证实淫羊藿苷对兔骨质疏松的良好临床疗效。

外源性淫羊藿苷对骨质疏松的作用表现在胫骨的骨小梁增加。且淫羊藿苷对长链非编码RNA(MEG3、H19、DANCR)的影响主要表现在股骨,对椎骨、颅骨的影响分别表现在MEG3和DANCR。

综上,淫羊藿苷可通过促进股骨MEG3、H19和DANCR的表达来促进骨质疏松的治疗。