胰腺癌循环肿瘤细胞的富集、鉴定方法及预后的评估价值*

丁善航 综述 修典荣 审校

(北京大学第三医院普通外科，北京 100191)

胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)预后很差，大多数患者诊断时已失去手术机会[1]，选择合适的肿瘤标志物对胰腺癌患者进行预后评估有助于选择及调整治疗方案以使患者生存获益，但目前胰腺癌尚缺少相关的高特异性和灵敏性的生物标记物。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入血液循环的肿瘤细胞，通过相关检测手段可在血液循环中检测到[2]。CTCs表达水平的高低与肿瘤恶性程度、辅助治疗疗效及预后相关，具有作为肿瘤特异性标记物的潜在价值[3～5]，但在循环中含量很少，难以被富集，成为限制研究的瓶颈。近年来，随着CTCs检测技术的不断进步，CTCs 作为肿瘤生物标志物进行预后评估的研究逐渐成为热点[6]。本文就CTCs主要的富集、鉴定方法及其在胰腺癌预后评估价值的相关研究做文献总结。

1 CTCs的富集和鉴定

1.1 CTCs的富集

CTCs在循环中分布和取样的部位有外周血和门静脉，外周血常用的取样部位有肘静脉、足背静脉等，由于取材方便、创伤小等优点，目前大部分CTCs研究采取该方式，但外周循环中CTCs数量极少，通常为0～102/ml[7，8]，对分离富集技术要求较高。对CTCs进一步的富集需要利用CTCs与血细胞在特定参数上的差异而筛选出CTCs，主要分为基于物理学特征和免疫学特征的富集方法两大类。由于富集纯度高以及保持细胞活性等方面优势，免疫学富集方法相较于传统物理学富集方法应用更为广泛，但物理学富集方法仍具有特有优势。

1.1.1 基于物理学特征的富集方法

密度梯度离心法利用分离介质及高速离心使存在密度差异的细胞群落分层从而分离富集CTCs，该方法富集CTCs的过程不受细胞表面标志物下调的影响，可获得较高的检出率。Buscail 等[9]对比密度梯度离心法和免疫学原理的RosetteSep系统的检测效率，结果显示密度梯度离心法更可靠，CTCs采收率为(56±23)%，明显高于RosetteSep系统采收率(39±27)%(P<0.001)。但该方法相对其他方法富集CTCs的纯度较低，活性较弱，限制了其使用。

膜滤过富集法利用CTCs直径大于其他血细胞的特点，通过滤膜过滤将CTCs与其他细胞分离而进行富集，常用的MetaCell、ISET系统即利用血样通过孔径为8 μm的高分子材料聚碳酸脂膜来过滤、分离、富集CTCs。该类方法能够较好地保持细胞原有形态，同时较少受CTCs表型改变的影响[10]，具有较高的富集性能[11]，但易混杂其他血细胞导致富集纯度偏低。

1.1.2 基于免疫学特征的富集方法

免疫学富集方法是利用CTCs和血细胞(白细胞、红细胞、血小板)及其他细胞抗原标志物的差异进行分选的一类方法。免疫磁珠分离法是目前最常用的CTCs富集方法之一，该方法利用特异性的单克隆抗体标记的磁珠结合肿瘤细胞表面特异性抗原来识别CTCs，其中以上皮源性恶性肿瘤均表达的上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)最常用，通过外加磁场作用吸附抗原-抗体复合物从而分离富集CTCs。由于原发性肿瘤细胞可发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等变化导致CTCs内部存在异质性，部分CTCs转变为间质表型不再表达EpCAM等上皮型标志物[12]，导致依赖上皮型标记物的免疫学富集方法CTCs采收率偏低[13，14]。

微流控芯片是一类检测过程可实现自动化的高分子微流控装置，采样、稀释、添加试剂、反应、分离等流程被集成到一块芯片上，可控流体在芯片中流动时CTCs 的生物标志物被芯片识别从而捕获样本中的CTCs。目前，最常用的生物标志物为EpCAM，主要有CTC-chip、CTC-HBchip、CTC-ichip和CMx等平台，这些微流控芯片优点在于富集流程高度自动化，且能使富集的CTCs保持较高的活性[15]，但仍然无法完全避免EpCAM下调导致的采收率偏低。Chikaishi等[16]报道一种非EpCAM依赖性检测的光固化树脂微流控平台，该芯片平台增加平足蛋白抗体这一非上皮型肿瘤标记物抗体，在同一样本条件下采收率相对于传统的EpCAM依赖性平台采收率增加78.3%。

1.2 CTCs的鉴定

1.2.1 免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)

ICC是利用抗原抗体特异性结合反应使荧光素、同位素、酶等显色剂显色来确定肿瘤细胞特异性抗原从而鉴定CTCs的方法，是目前使用最广泛的CTCs测定方法。CellSearch系统的细胞鉴定部分即为该原理[17]。CellSearch系统是唯一通过美国FDA批准多用于临床乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌的CTCs检测系统，在胰腺癌CTCs中应用也取得一定进展。CTCs经免疫细胞化学染色法鉴定主要表现为上皮型标志物抗体如EpCAM、上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、细胞角蛋白8/18/19(cytokeratin 8/18/19，CK8/18/19)抗体等[18～22]标记为阳性，血细胞特异性标志物如CD45等抗体标记阴性。由于EMT的存在导致部分CTCs转变为非上皮表型，使依赖上皮型标志物的ICC技术鉴定存在误差[23]。近年来，一些非上皮型标志物如波形蛋白(Vimentin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)、锌指结构E-box结合蛋白1(Zinc finger E-box binding homebox 1，ZEB1)等的应用提高了CTCs的检出率[12，24，25]。但目前TCC尚无统一的 CTCs 标记物鉴定方案及标准，使用不同标记物方案的ICC方法的研究鉴定结果存在较大差异。

上皮细胞免疫斑点法(epithelial immunospot，EPISPOT)使用涂有特定标记物抗体斑点的硝化纤维素膜与待测样本中肿瘤细胞分泌蛋白结合产生抗原-抗体反应，再采用摄像机成像和计算机辅助分析技术对免疫反应斑点进行分析以鉴定CTCs的技术，该技术是目前唯一能在单细胞水平上测定有活性细胞的CTCs的鉴定方法，已用于结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤类型[26]。Budna等[14]利用 EPISPOT、CellCollector、CellSearch 3种检测方法测定前列腺癌CTCs，结果显示相同样本EPISPOT的检出率(54%)高于CellCollector(52%)和CellSearch(13%)，EPISPOT 技术相对于EpCAM依赖性测定方法有更高的临床应用价值。但因死细胞、无活性细胞不能分泌足够的蛋白质以进行检测，该法仅能测定有分泌功能的活性CTCs，且目前缺少胰腺癌CTCs特异性分泌蛋白标志物，该技术胰腺癌相关的应用及研究较少。

1.2.2 荧光原位杂交术(fluorescence in situ hybridization，FISH) FISH通过将荧光核酸探针以碱基互补配对的方式，与待测样本中的特定细胞核酸序列配对杂交测定CTCs，具有实验周期短、特异性好、定位准确等优点[27]，常应用于CTCs相关染色体易位片段的研究。FISH与免疫学测定方法联合使用可以提高CTCs检出率，是目前应用于CTCs检测的主要形式。Xu等[28]用8号染色体阴性富集联合FISH NE-iFISH系统检测40例PDAC外周血CTCs,阳性率为90% (36/40)，ROC曲线显示当截断值为1.5 CTCs7.5 ml时，对CTCs的检测灵敏度为77.5%，特异性为79.1%，同一标本条件下镜检NE-iFISH系统测得CTCs亚型多样性明显强于CellSearch系统。Ko等[29]报道1种免疫磁珠与RNA荧光原位杂交技术(Turbo RNA FISH)相结合的新型CTCs检测平台，由于具备FISH的高特异性和磁微孔对CTCs的高敏感性，有早期诊断胰腺癌的潜力，但联合检测方案操作步骤相对复杂，容易造成信号丢失出现假阴性，对设备和试剂水平要求较高，一定程度上限制其推广应用。

1.2.3 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) RT-PCR通过PCR技术扩增并识别肿瘤特异性mRNA序列的逆转录DNA片段从而对CTCs进行测定。目前，胰腺癌CTCs常用的mRNA序列有CK20 mRNA、CEA mRNA、EpCAM mRNA等[30]。由于技术手段成熟且特异性高，RT-PCR已成为目前最主流的CTCs测定方法之一，广泛应用于多种类型肿瘤CTCs 的检测及其预后研究[31]。RT-PCR同时也是胰腺癌 CTCs 分子生物学标志物研究及生物治疗靶点研究的重要方法。Xu等[32]采用RT-PCR检测并发现胰腺癌CTCs中受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)mRNA表达水平升高，ROR1有成为胰腺癌治疗靶点的潜在价值。

1.2.4 流式细胞术(flow cytometry，FCM) FCM是一项以细胞荧光化学及单克隆抗体技术为基础，能够对单细胞或其他生物粒子进行定量高速分析和分选的测定手段，能同时从一个细胞中测得细胞内DNA含量、细胞活力及细胞特异性标志物等多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等显著优点。Guglielmi等[33]采用ClearCell FX1系统(基于肿瘤细胞标记物 EpCAM、CD45等)标记胰腺癌患者 CTCs并使用流式细胞仪分离CTCs，获得较高的检出率(60%)的同时保持CTCs的完整性。主要缺点在于灵敏度还不够高，存在细菌污染、细胞凝集等问题[34]。近年来，以FCM为基础的许多新型技术如活体无标记光声流式图像细胞仪(photoacoustic flow cytometry, PAFC)、单细胞网络谱分析细胞仪、声波聚焦细胞仪等提高CTCs测定效率和灵敏度，具有无创检测、异质性亚群分析等优势[34～37]。

2 CTCs检测在胰腺癌预后评估中的应用

2.1 CTCs与胰腺癌预后

胰腺癌常用的标志物CA19-9、CA242等灵敏度、特异度较差，仍缺少高特异性的预后评估标志物[38]。CTCs是恶性肿瘤转移前亚群具有作为潜在预后评估标记物的价值[14]。Yang等[39]采用免疫荧光细胞化学方法检测胰腺癌患者外周血CTCs，外周血<3 CTCs7.5 ml组总体生存期显著长于≥3 CTCs7.5 ml组(15.2月 vs. 10.2月,P=0.023)，多因素分析显示单位外周血高 CTCs计数是胰腺癌预后较差的独立危险因素(HR=4.547，95%CI: 1.323～15.625，P=0.016)。

由于EMT等分子生物学改变的发生，CTCs群体内部存在异质性，不同表型CTCs的预后评估价值也存在一定差异。Katherine等[40]通过免疫荧光法用细胞角蛋白、波形蛋白抗体鉴定50例胰腺癌外周血CTCs，结果显示39例(78%)CTCs为单纯上皮表型，表达细胞角蛋白而不表达波形蛋白，26例(67%)CTCs表达细胞角蛋白的同时也表达间质标志物波形蛋白，外周血中只表达上皮表型标志物的CTCs检出是胰腺癌患者总生存期短的独立危险因素(P<0.01)，表达上皮和间质表型的CTCs检出是肿瘤复发的预测因子(HR=2.78, 95%CI：1.31～5.88,P=0.01)。

利用CTCs与胰腺癌预后的相关性，对CTCs进行动态检测可用以评估辅助治疗的疗效，指导治疗方案的调整及选择[41，42]。Anemura等[43]采用ICC检测16例胰腺癌新辅助放化疗(吉西他滨、爱斯万S-1联合全剂量放疗)前、新辅助放化疗治疗1个月后、手术切除后外周静脉血CTCs，结果显示截止新辅助放化疗前，4例CTCs阳性者术后肝转移率高于11例CTCs阴性者(50% vs. 0%)，此4例化疗后CTCs持续升高，2例在R0切除后早期发生肝转移并死亡，建议CTCs阳性患者选择先手术再行化疗的策略。

2.2 门静脉CTCs的检测及其预后评估价值

门静脉CTCs的预后研究相对外周血较少，由于未经肝脏滤过相对于外周血在CTCs检出率上更具优势[44]，为CTCs的亚群研究、免疫抑制机制研究提供更多细胞来源[45]，目前尚无研究显示门静脉CTCs群落和外周血CTCs群落在分子表型上存在明显差异。目前，门静脉CTCs标本常见的获取方式有术中暴露门静脉及其分支，抽取门静脉循环血液标本[46]以及通过超声引导下肝穿刺从门静脉系统中获取标本[47]2种方式。获取标本后CTCs的富集及鉴定技术基本同外周血CTCs。

门静脉CTCs作为胰腺癌预后评估指标的价值在多个研究中得到证实。Liu等[47]超声引导下经肝穿刺对晚期胰腺癌门静脉血液中的CTCs进行分析，29例门静脉标本均检测到CTCs，转移患者门静脉CTCs平均为449.0/7.5 ml，明显高于16例局部进展期161.0/7.5 ml(P=0.0054),门静脉CTCs高计数与肿瘤转移存在相关性；11例门静脉CTCs低于150/7.5 ml，中位总生存期19.8周(95%CI: 16.8～25.4)，显著长于17例门静脉CTCs高于150/7.5 ml的中位总生存期9.2周(95%CI：7.8～11.8)，门静脉CTCs>150/7.5 ml预示患者OS显著缩短(log-rank检验，P<0.0001)。

除此之外，门静脉CTCs作为预后评估标志物价值与外周血CTCs存在的差异在多个研究中报道，门静脉血中CTCs的高表达与胰腺癌术后早期发生肝转移存在显著的相关性[48，49]。Tien等[50]检测41例PDAC体循环和术中门静脉CTCs，术后每3个月复查肝脏MR，多因素分析显示门静脉CTCs的数量是术后6个月内肝转移的唯一独立影响因子(OR=1.0122, 95%CI：1.0053～1.0226,P=0.0042)，术后早期肝转移患者门静脉CTCs计数显著大于无早期肝转移患者(402.94±838.77 vs 29.72±43.56，P<0.001),早期肝转移与无早期肝转移患者外周静脉CTCs计数无统计学差异(61.18±112.48 vs.19.19±29.69,P=0.296)。

2.3 CTCs与胰腺癌预后相关性的分子生物学证据

随着各种新型分子生物学层面检测工具的应用，CTCs的检测流程已不再局限于CTCs的富集和鉴定计数，还可以对CTCs特异性肿瘤标志物进行分子生物学参数测定，CTCs的具体测定工具及方法本文不再展开叙述。EMT等分子生物学改变被证实可提高肿瘤细胞的存活率和侵袭性[14]，多个CTCs相关的肿瘤信号转导通路及组件在促进肿瘤增殖、进展的作用被发现，为CTCs表达与患者预后的相关性不断提供新的分子生物学证据。杨静等[51]对48例胰腺癌CTCs的研究结果显示，胰腺癌术后复发者TLR4、TLR9、myd88表达水平明显高于未复发者(TLR4：3.16±1.02 vs.2.34±0.46；TLR9:3.34±1.09 vs. 2.68±0.65；myd88：2.76±0.67 vs.2.12±0.55；P<0.05)，CTCs中TLRs/myd88信号表达水平与转移、复发密切相关。近年来的研究显示，TGFBI基因、KRAS突变基因、PD-L1、MUC-1、BIRC5等多个CTCs相关信号传导组件的异常表达在胰腺癌及其他恶性肿瘤细胞增殖、迁移和信号转导过程中的潜在促进作用[52～55]。

CTCs 在炎症微环境中与中性粒细胞、淋巴细胞、调节性T细胞(Treg细胞)、PD-1(+)、CD8(+)T细胞等免疫细胞的相互作用可促进CTCs发生免疫逃逸[56～58]。Tao等[47]采用免疫荧光法检测160例胰腺癌癌旁血管采集的血样中CTCs，免疫荧光结果显示PDAC患者肿瘤邻近血管中CTCs被白细胞群落包围，中性粒细胞/淋巴细胞比例与术后远处转移有显著相关性(HR=2.15, 95%CI：1.279～3.615,P=0.004)，提示血液中CTCs与中性粒细胞可能通过某种相互作用而协助其远处转移。

尽管目前大部分同类研究中CTCs与胰腺癌预后的相关性得到肯定，但仍有部分研究得出阴性结果。Sergeant等[59]应用RT-PCR检测40例PDAC胰腺切除术外周血和腹腔积液EpCAM阳性肿瘤细胞，血液和腹腔积液EpCAM阳性肿瘤细胞的检出与胰腺癌生存期无相关性(血液：log-rank检验，P=0.17；腹腔积液：log-rank检验，P=0.28) ，CTCs的预后评估价值目前仍存在一定的争议。

3 结语

CTCs在循环中含量较少,内部异质性较大，对富集检测技术要求较高。近年来，检测技术不断进步，许多新型的检测手段具有检测过程高度自动化，可避免因CTCs表面标志物下调所致的检出率降低，能够获取大量有活性的CTCs，对CTC进行多参数的分析等优点。CTCs 与胰腺癌预后的相关性目前已在多个研究中得到初步验证，分子生物学机制的研究进展也印证了CTCs作为预后评估标志物的潜在价值。对CTCs的预后评估价值的研究应开展更多大样本、多中心、多参数、前瞻性的研究，制定标准化CTCs检测方案及鉴定标准，进一步推动其在临床实践中的应用。