微齿菝葜CDDP - PCR体系优化、引物筛选及多态性分析

张晴　臧德奎

摘要：利用正交试验对微齿菝葜CDDP - PCR反应体系的模板DNA和引物浓度进行优化。最优CDDP -PCR反应体系为：2×Es Taq MasterMix酶（含染料）10μL，0.4μmol/L引物，40 ng DNA模板，ddH7 0补齐至20μL。利用该优化体系从21条通用引物中共筛选出12条条带清晰、多态性好的引物。利用筛选好的引物对105个微齿菝葜样品进行扩增，共得到229个位点，其中多态性位点225个，占总位点数的98.25%。本试验表明CDDP分子标记对于微齿菝葜的遗传多样性分析、分子图谱构建及性状基因连锁研究具有重要价。

关键词：微齿菝葜;CDDP分子标记;体系优化;引物筛选;多态性分析

Reaction System Optimization and Primer Screening ofCDDP - PCR and Polymorphism Analysis of Smilax microdontaZhang Qing， Zang DeKui

Abstract

In order to construct the optimal CDDP - PCR reaction system of Smilax microdonta， the or-thogonal experiment was designed with the factors of template DNA and primer concentration. The optimal sys-tem was established as follows ： 2 x Es Taq MasterMix enzyme （containing dyes） 10 μL， 0.4μmol/L prim-er， 40 ng DNA template， and ddH20 supplemented t0 20 μL. A total of 12 primers with clear bands and goodpolymorphism were screened from 21 universal primers using the optimized system. One hundred and five sam-ples of Smilax microdonta were amplified with the screened primers， and 229 loci were obtained， of which 225were polymorphic loci， accounting for 98.25% of the total number of loci. This experiment demonstrated thatCDDP molecular markers were of great value for genetic diversity analysis， molecular map construction and studyon linkage of trait genes of Smilax microdonta.

Keywords Smilax microdonta; CDDP molecular marker; System optimization; Primer screening; Poly-morphism analysis

微齿菝葜（Smilax microdonta）为菝葜科菝葜属落叶小灌木，零星分布于山东省枣庄市抱犊崮、湖北省神农架和江苏省宜兴市，与菝葜近缘[1]。菝葜属植物在民间以根茎人药，植株中含有甾体皂苷类、黄酮类、甾醇类、芪类和苯丙素等类型化合物，对心血管疾病的防治、免疫调节、抗菌抗炎、抗病毒、抗癌等具有良好的作用，临床疗效确切[2-4]。微齿菝葜形态与菝葜相似，在分类上易混淆[5]，往往造成药材的误采、误收、误用等问题。近年来，因过度采挖，分布区旅游开发加上河流冲刷等自然条件干扰，微齿菝葜生境破坏严重，野生资源有所减少。因此对种质资源进行保护和遗传多样性研究十分必要。CDDP（ conservedDNA - derived polymorphism）分子标记是Collard和Mackill在2009年开发的一种基于DNA保守序列的新型分子标记技术[6]。它针对植物功能基因或基因家族中保守氨基酸序列设计单条引物，可产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记，其PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳即可分离，多态性丰富，稳定性好。与随机分子标记相比，CDDP分子标记可更有效地与目标性状连锁，具有操作便捷、应用成本低、引物设计简单且通用性良好等优点，在遗传多样性分析和分子标记辅助育种中具有重要的应用价值，前景较为广阔[7]。目前CDDP分子标记已成功应用于大豆[8]、牡丹[9]、菊花[10]、越橘[ll]、野生玫瑰[12]和铁皮石斛[13]等资源的遗传多样性分析、品种鉴定以及性状关联研究等方面。

由于微齿菝葜发现时间较晚，目前尚无相关的研究报道。本研究以山东省枣庄市分布的微齿菝葜为材料，利用正交试验建立并优化其CDDP -PCR反应体系，进而对该体系进行稳定性验证、筛选高效的CDDP引物、应用该分子标记分析微齿菝葜资源的多态性，以期为后续微齿菝葜遗传多样性分析和分子标记育种奠定基础，同时为药用资源的合理开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

微齿菝葜分别采自山东省枣庄市抱犊崮景区、东庄和徐庄。采集无病虫害和机械损伤的新鲜嫩叶，共105份样品，经硅胶干燥，于-20℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA提取 DNA提取参考改良CTAB法[14]并做相应改进。具体操作如下：取0.15～0.18g干燥叶片，加少许聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸，液氮研磨成粉末后转移至2mL离心管中，加入1mL预冷提取介质，混匀，4℃静置10 min后离心，弃上清，重复2～3次，至上清液清透;加入50μL β-巯基乙醇、800μL预热的CTAB缓冲液和10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀，65℃水浴th，并不时轻微振荡;冷却至室温，加200 μLTris酚试剂、600 μL氯仿异戊醇（24：1），颠倒混匀10 min，40℃、12000 r/min离心10 min;转移上清液至新离心管，加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀10 min，40C、12 000 r/min离心10 min，重复两次该步骤;加50 μL 3 mol/L醋酸钠，颠倒混匀，10 000 r/min离心5 min;加800 μL预冷无水乙醇，-20℃静置30 min;4℃、12000 r/min离心3min;70%乙醇洗涤DNA沉淀3次，室溫干燥30min，加50μL TE溶解DNA。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Nano-drop 2000分光光度计测定纯度和浓度，-20℃保存备用。