杨梅iPBS—PCR反应体系的建立与优化

郭志海　王鹏凯　郄红丽等

摘要：利用已报道的iPBS引物2249 和3个杨梅品种的DNA为模板进行iPBS-PCR扩增，采用单因素法对杨梅iPBS-PCR反应体系的4个组分（dNTP、Mg2+、引物、模板）用量进行优化，确定了杨梅iPBS-PCR 20 μL反应体系：2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA。梯度PCR试验表明可以参考iPBS引物Tm值确定退火温度。利用上述体系对随机取样的10个品种用4条iPBS引物进行扩增，得到了条带清晰、多态性好的iPBS谱带。

关键词：杨梅；iPBS-PCR；体系优化

中图分类号： S667.601文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0051-04

收稿日期：2015-05-13

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）2011]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2012361）；国家公益性行业（农业）科研专项（编号：20120389）；江苏省农业三新工程[编号：SXGC（2014）076]。

作者简介：郭志海（1965—），男，江苏江阴人，高级农艺师、副教授，主要从事园艺种质资源研究。E-mail：Gzh8115@163.com。

通信作者：王鹏凯，讲师，主要从植物分子生物学研究。E-mail：mengxiao02181@hotmail.com。杨梅（Myrica rubra） 是杨梅科杨梅属常绿小乔木，原产于我国，主要生长在长江流域以南的丘陵山地。杨梅果实营养丰富，具有较强的保健功能，是南方经济效益较高的水果之一[1]。我国杨梅栽培历史悠久，生态环境的多样性产生了性状多样的品种、品系和类型，形成了丰富的种质资源。利用形态学、同工酶等方法鉴定杨梅种质资源局限性大、效率低。因此，常利用分子标记对杨梅种质资源进行分析，包括遗传多样性、亲缘关系分析、品（杂）种鉴别等方面。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR、iPBS、ScoT等技术[2-7]在杨梅中都已得到应用[8]。

iPBS是以LTR类反转录转座子保守位点设计引物进行扩增的一种分子标记技术，针对LTR类反转录转座子中2个PBS（引物结合位点）区间进行扩增[9]。该方法简单、有效，可节约大量人力、物力，不用预先获知LTR序列，直接进行引物筛选。目前，该技术已经成功应用于亚麻[10]、大麦、小麦、苹果、玉米[9]、葡萄[11]等的研究。当材料、方法不同时，需对扩增条件进行优化才能得出更科学的标记谱带。本研究利用单因素试验对杨梅iPBS-PCR反应体系进行优化，通过对电泳结果的分析建立了杨梅iPBS-PCR反应体系。同时利用该反应体系对已有的iPBS引物进行初步筛选，研究结果将为使用iPBS标记评价、鉴定杨梅种质资源提供了技术基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用的杨梅种质资源材料均采自江苏省太湖常绿果树技术推广中心国家杨梅种质资源圃，杨梅品种为晚稻（浙江舟山）、狗色头（江苏常熟）、浪荡子（江苏苏州东山）。PCR试剂购于TaKaRa公司（10×rTaq buffer，2.5 μmol/L dNTP，25 μmol/L MgCl2，5 U/μL rTaq ），引物由上海生工合成（溶解至10 μmol/L）。

1.2试验方法

1.2.1杨梅DNA提取与检测杨梅基因组DNA提取采用改良CTAB快速提取法[12]。将杨梅嫩叶直接在CTAB提取液中匀浆，经过抽提、沉淀、溶解等步骤得到基因组DNA溶液。获得的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。通过紫外分光光度计测定260、280 nm 处的吸光度，用于测算DNA纯度（D260 nm/D280 nm）、浓度（D260 nm）。完成浓度测定的DNA溶液进一步稀释成10 ng/μL的工作液，用于后续PCR反应。

1.2.2杨梅iPBS-PCR反应体系优化杨梅iPBS-PCR扩增反应总体积为20 μL，选择在葡萄iPBS-PCR反应体系优化中使用的2249引物（5′-AACCGACCTCTGATACCA-3′）进行PCR扩增（预试验结果显示该引物在杨梅中扩增效果较好）[11]。采用单因素法对2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L Mg2+、10 μmol/L引物、模板用量进行试验，其中包括：（1）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，0.2 μL Taq酶，1.6 μL dNTP，Mg2+用量设为1.2、1.4、1.6、1.8 μL，DNA模板用量设为5、10、15、20、25、30、50 ng，用以确定最佳Mg2+和模板DNA用量。（2）2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL dNTP，1.6 μL Mg2+，0.2 μL Taq酶，2 249引物用量设为1、2 μL，DNA模板用量设为10、20、30、40 ng，用以确定引物与模板的最佳比例和用量；（3）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，30 ng DNA模板，0.2 μL Taq酶，1.6 μL Mg2+，dNTP用量设为1.2、1.6、2.0 μL，用以确定dNTP的最佳用量。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳方法进行检测，通过紫外凝胶成像系统对不同反应体系进行评价，筛选出适合杨梅iPBS-PCR最佳反应体系。

1.2.3杨梅iPBS-PCR反应程序本试验中杨梅iPBS-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，49～59 ℃（2 ℃/梯度，共6个梯度）退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保温。PCR产物评价方法与“1.2.2”节相同，显示出退火温度对杨梅iPBS-PCR反应的影响，用以确定最佳退火温度。

2结果与分析

2.1基因组DNA提取与质量控制

电泳检测结果（图1）表明得到的杨梅基因组DNA主带明亮，无明显拖尾，经RNA酶处理后RNA降解较好。分光光度计检测结果表明70 mg新鲜叶片可以得到2～3 μg基因组DNA，经RNA酶处理后D260 nm/D280 nm在1.65～1.90之间，纯度较好。

2.2PCR反应各因素对iPBS-PCR扩增反应的影响

选用3个品种的杨梅基因DNA进行iPBS-PCR反应，测试不同反应体系下的扩增效果，筛选PCR反应各因素的优化组合。

2.2.1Mg2+浓度对iPBS-PCR的影响PCR反应中的Mg2+对扩增的特异性和Taq酶活性有明显的影响。随着Mg2+用量的增加，扩增出的谱带逐渐增多且亮度也逐步增加，弥散情况基本良好，有利于谱带的判读；但Mg2+用量增至1.8 μL时，部分谱带的弥散程度有所增加，可能增加差异较小的谱带判读难度，进而影响后续的结果分析。为了结果的一致性，在测试时设置了7个模板用量（5、10、15、20、25、30、50 ng），发现Mg2+用量对iPBS-PCR的影响在不同模板量的情况下是一致的（图2）。因此，在本研究中1.2～1.8 μL Mg2+用量均适宜杨梅的iPBS-PCR反应，但是为了平衡谱带数量和判读质量，在后续试验中Mg2+用量固定为1.6 μL。

2.2.2模板DNA用量对iPBS-PCR的影响模板用量是PCR体系的重要影响因素，杨梅iPBS-PCR的预试验中就发现100 ng以上的模板用量会导致扩增失败。当Mg2+用量固定为1.6 μL时在5～50 ng模板量范围内，模板量的改变对iPBS-PCR影响较大（图3）。当模板量增加时，扩增出的谱带逐渐增多、亮度也有所增加，并且这种影响在3个杨梅品种中具有一致性；对于得到谱带较多的品种，当模板量增至50 ng时弥散程度增加，影响了结果分析。因此 综合考虑以上结果，确定后续试验中模板DNA用量为30 ng。

2.2.3引物用量对iPBS-PCR的影响引物用量对扩增的特异性和谱带的清晰度有明显影响。当引物用量由1 μL增加至2 μL后，谱带数量减少且弥散情况比较严重， 谱带的特

征性也发生变化；本试验中同时使用3个品种、4个模板梯度，电泳结果显示引物用量增加对杨梅iPBS-PCR的影响是一致的（图4）。因此，综合分析电泳结果，确定后续试验中引物用量为1 μL。

2.2.4dNTP用量对iPBS-PCR的影响dNTP用量与PCR反应的扩增效率关系密切。当dNTP用量为1.2 μL时，扩增效率低、谱带亮度不足；随着dNTP用量增加，条带逐渐变亮，但是过多的dNTP（2.0 μL）会使谱带中的主带亮度大大增加，从而影响其它条带的判读（图5）。因此，后续试验中dNTP用量确定为1.6 μL。

2.2.5杨梅iPBS-PCR最优化体系通过一系列的单因素测试，综合分析电泳结果，建立20 μL杨梅iPBS-PCR扩增体系（表1）。

表1杨梅iPBS-PCR优化体系

成分加入量（μL）10×Taq buffer2.025 mmol/L Mg2+1.62.5 mmol/L dNTP1.610 μmol/L 引物1.05 U/μL Taq酶0.210 ng/μL 模板DNA1.0灭菌ddH2O12.6

2.3退火温度对扩增反应的影响及杨梅iPBS-PCR优化体系验证

2.3.1退火温度对iPBS扩增反应的影响PCR程序中的退火温度直接决定了引物扩增的效果，对产物的特异性有重要的影响。在分子标记中，退火温度可以直接影响谱带特征。报道的引物2249理论退火温度为51 ℃，合成报告Tm值为53 ℃，为检测不同退火温度对扩增反应的影响，以浪荡子为材料，在“2.2.5”节优化体系的基础上设置49～59 ℃（2 ℃/梯度）共6个退火温度进行扩增反应；电泳结果显示随着退火温度的升高，得到的谱带逐渐减少，谱带特征发生很大变化（图6）；比较发现以Tm值（53 ℃）为退火温度得到的谱带数目较多且比较清晰， 因此在选择不同引物退火温度时推荐使用Tm值作为参考进行上下调节。

2.3.2优化体系下的扩增效果从杨梅资源圃中随机挑选10个品种提取DNA，并在已报道的iPBS引物中随机选择4条引物，以优化后的反应体系为基础、引物Tm值作为退火温度，进行iPBS-PCR扩增反应，验证优化体系和退火温度设置的有效性。结果（图7）显示，4条引物均扩增出清晰的谱带且多态性明显，说明上述优化体系的确适用于杨梅iPBS分子标记。

3结论与讨论

高等植物中过半的重复DNA由反转录转座子组成，它们散布于各染色体上，是动态的基因组组件，有能力整合新的拷贝，促进内部染色体重组[13]。用其开发分子标记，信息量高，多态性好，但是iPBS分子标记也是基于PCR反应的分子标记，虽然多态性非常丰富，但是与其他分子标记一样受到多种因素的影响。试验的稳定性和可靠性与PCR反应体系和条件关系很大，因此在使用前需要对反应体系进行优化。PCR体系中的各个组分不仅在绝对用量方面决定反应的扩增效果，各个组分之间的比例也会对反应造成影响。除此以外，扩增程序尤其是退火温度对iPBS分子标记的谱带特征影响非常大，本试验的测试结果同样支持此观点。综合本试验的扩增结果，可以看出杨梅iPBS-PCR反应体系中的各个组分在一定的用量范围内均可以得到较好的扩增效果， 因此在实际试验过程中应该根据引物和模板的实际情况进行调整，最终得到最佳效果的分子标记谱带信息。本研究利用单因素法获得了适用于杨梅iPBS标记检测的PCR体系，即在20 μL反应体系中：2 μL 10 × Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA，灭菌ddH2O补足20 μL。该反应体系重复性好，多态性高，有利于谱带的判读。本试验结果将为利用iPBS-PCR技术进行杨梅种质遗传多样性评价及鉴定提供技术支持，也将为应用于其他植物的研究提供借鉴。

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