ROCK1基因在鼻咽癌组织中的表达及其与细胞侵袭的关系

田双双，王俊美，崔云东，张礼涛

鼻咽癌是一种恶性的上皮细胞肿瘤。在世界范围内，我国鼻咽癌的发病率和病死率是最高的。鼻咽癌通常具有侵袭和转移的特性，而这一特性却导致许多鼻咽癌病人死亡[1]。研究发现，95%的鼻咽癌在早期就发生了肿瘤的侵袭和转移[2]。因此，鼻咽癌侵袭相关因子的研究，成了治疗该病的重中之重。但是目前关于鼻咽癌的侵袭相关因子还未见明确报道。

Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled coil-containing protein kinase,ROCK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是RhoA的下游效应蛋白。文献报道，ROCK有两种异构体，分别是ROCK1和ROCK2，其中ROCK1蛋白具有调节细胞骨架重组和细胞粘附等作用，ROCK1的调节作用，使其具有调节细胞运动和细胞迁移的功能[3]。

虽然ROCK1在诸多癌症中被研究，但其与鼻咽癌的相关性并没有去阐述。这个研究，将收集鼻咽癌住院病人30例，并收集同期住院的鼻咽癌病人的癌旁组织作为对照，通过免疫组织化学法和蛋白质印迹法(Western Blot)，分析鼻咽癌中，ROCK1的表达情况；然后使用ROCK的抑制剂Y-27632处理鼻咽癌细胞株6-10B，来揭示ROCK1与鼻咽癌细胞侵袭的关系，以此来评估鼻咽癌中ROCK1的临床学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 于2016年1—12月，在临沂市河东区人民医院收集30例鼻咽癌病人病理组织，同期收集30例鼻咽癌的癌旁组织。所选标本都由该院两个病理科同事，进行双盲病理学检查确诊，这些标本都未进行化疗治疗。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，并且所选病人均签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 二氧化碳培养箱(型号371)购自Thermo公司；移液器、高速低温离心机(型号5810R)购自eppendorf公司；超低温冰箱(型号MDF-192)购自SANYO公司；垂直电泳仪购自BioRad公司；免疫组化试剂盒、BCA protein assay kit(P0010)购自碧云天生物试剂公司；ROCK1抗体(#4035)购自Cell Sinnalling Technology公司；β-actin(BM0627)、二抗(BM2002)购自博士德公司。

1.3 免疫组织化学 将病理组织进行石蜡包埋，石蜡包埋后，进行切片，厚度为4 μm，将切片置于载玻片上，放在60 ℃烘片机上烘烤1 h；再置于二甲苯I中浸泡5 min，二甲苯Ⅱ中浸泡5 min；乙醇梯度水化；然后在蒸馏水中浸泡2 min；进行柠檬酸盐抗原修复，将玻片置于室温自然冷却后。毎张切片滴50 μL，3%过氧化氢，室温30 min，PBS洗3次，每次5 min；每张切片使用50 μL 10%山羊血清进行封闭，室温封闭30 min；每张切片滴加ROCK1抗体，37 ℃，2 h；PBS冲洗3次，每次3min；滴加二抗，室温30 min；PBS冲洗3次，每次3min；再滴加链霉素康生物素蛋白-过氧化酶，室温30 min；PBS冲洗3次，每次3min；用新鲜配制的DAB显色3min，在显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗终止染色；PBS冲洗3次，每次3min；苏木素复染，自来水冲洗后1%盐酸分化，自来水冲洗5 min；梯度脱水，切片烤干，中性树胶封片，阅片。

1.4 细胞培养 鼻咽癌细胞株6-10B培养在RPMI1640(含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)培养基中。永生化鼻咽上皮细胞株NP69培养在KMSF培养基中。将细胞株置于37 ℃、5%二氧化碳的全湿环境下，进行培养。当细胞生长到融合度为80%左右时，进行细胞传代培养。在进行实验时，当细胞生长到对数生长期时，进行下一步实验处理。

1.5 药物处理 对鼻咽癌细胞株6-10B进行ROCK1抑制剂(Y-27632)的处理。当细胞培养到对数生长期时，将Y-27632加入到细胞培养基中，分别设两个浓度进行培养，10 μM和30 μM，在药物处理1 h后，收集细胞，进行后续实验。

1.6 Western Blot 使用含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA蛋白裂解液裂解细胞，提取总蛋白；使用BCA法进行蛋白浓度测定。然后制备10%的SDS-PAGE凝胶，将蛋白加入上样Buffer后，加入孔中，进行垂直电泳，之后在全湿环境下，转膜(PVDF膜)，使用5%的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭，加入ROCK1抗体进行4℃，过夜孵育。第2天PBS洗3次，每次5 min，再进行HRP-二抗孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，最后进行ECL发光液处理，暗室曝光。

1.7 细胞侵袭实验 在Transwell小室的提篮底部铺上ECMatrix胶，然后在里面加入PRMI1640培养基，置于37 ℃培养箱中。在Transwell小室的下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，上室加入不含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，每孔加入一定浓度的细胞悬液，设置3个复孔，培养24 h后，进行染色，空气中干燥。

2 结果

2.1 临床标本中ROCK1的表达升高 在临床组织标本中，使用免疫组织化学法检测ROCK1在鼻咽癌组织中的表达情况(图1)。图中棕褐色为ROCK1阳性表达，蓝色部分为ROCK1的阴性表达，观察结果显示，30例鼻咽癌组织中，有18例阳性，12例阴性；而对照组中只有2例阳性。说明鼻咽癌组中ROCK1的表达明显高于对照组(χ2=19.20,P<0.000 1)。

2.2 细胞株中ROCK1的表达 为了揭示鼻咽癌中ROCK1的表达情况，使用了鼻咽癌细胞株6-10B和永生化鼻咽上皮细胞株NP69，通过Western Blot方法，检测在细胞株中ROCK1的表达情况，如图2所示，与对照组(NP69)(0.43±0.08)相比，鼻咽癌组(6-10B)细胞中的ROCK1的表达(1.25±0.23)明显升高(t=3.187，P=0.033)。

图2 ROCK1在鼻咽癌组(6-10B)和对照组(NP69)细胞株中的表达

2.3 药物处理后6-10B中ROCK1表达 对鼻咽癌细胞株6-10B进行药物处理后，通过Western Blot方法，检测在细胞株中ROCK1的表达情况。如图3所示，未处理为(2.6±0.54)，10 μM Y-27632处理为(1.2±0.78)，30 μM Y-27632处理为(0.73±0.12)。随着Y-27632的浓度增加，ROCK1的表达减少，差异有统计学意义(F=5.76，P=0.04)。

图3 Y-27632处理前后ROCK1的表达：1为未处理；2为10 μM Y-27632处理；3为30 μM Y-27632处理

2.4 Transwell小室检测药物处理前后细胞侵袭能力 以6-10B未处理组作为对照组，Y-27632的10 μM和30 μM为实验组，通过Transwell小室实验，检测Y-27632处理前后细胞的侵袭能力。在560 nm处记录数值，三个组的数据为(171.67±17.89)、(120±19.07)和(67.33±13.58)，差异有统计学意义(F=29.65，P=0.0008)。

注：a表示与1相比，t=3.45，P=0.025；b表示与1相比，t=8.40，P=0.001 1图4 Y-27632处理前后6-10B细胞的侵袭能力：1为未处理；2为10 μM Y-27632处理；3为30 μM Y-27632处理

3 讨论

鼻咽癌是一种异质性实体瘤，我国为鼻咽癌高发区，尤其是华南和香港等地区[4-5]。在2010年，报道显示，在我国华南地区鼻咽癌的发病率和死亡率均为19.5%，包括香港在内，每10万人有7.7人高发鼻咽癌[6]。目前关于鼻咽癌的病因，大致总结为：遗传成分，如染色体1、3、9、11、12和14的畸变；感染因素，如Epstein Barr病毒(EBV)和环境因素等。根据WHO分类，鼻咽癌的病理类型分为角化性鳞状细胞癌(I型，称为高分化)，分化鼻咽非角化性癌(Ⅱ型，称为中度分化)，未分化癌(Ⅲ型，称为低分化)[7]。事实上，在上述发病率高的地区，至少有95%的鼻咽癌病人是低分化的病理类型[8]。目前放疗和化疗是鼻咽癌的主要治疗手段[9]。但不幸的是，大约有20%的鼻咽癌病人在治疗后仍有局部复发[10-11]。在鼻咽癌复发因素中，鼻咽癌的细胞侵袭性，被认为起到了重要的作用。

ROCK1蛋白在细胞骨架蛋白重排和细胞粘附上，具有重要作用。有文献报道，ROCK1蛋白在乳腺癌、肺癌及肝癌中都有高表达[3]。在本研究中，我们使用临床标本和细胞株发现，ROCK1在实验组中的表达均明显高于对照组，提示ROCK1蛋白与鼻咽癌的发生存在相关性，这与我们及其他研究者[12]在其他实体瘤中的报道相一致。先前研究表明，ROCK1的高表达可以促进肿瘤细胞的侵袭[13-14]。Rho/ROCK信号通路是细胞侵袭的重要机制之一[15-16]。当Rho GTP结合ROCK蛋白后，ROCK蛋白构象发生了改变，将其催化结构域充分暴露了出来，从而使ROCK可以激活下游效应分子[17]。在前列腺癌和其他恶性肿瘤中，研究者均发现，ROCK1在促进肿瘤的侵袭和转移中，起到了非常重要的作用[18]。在本研究中，我们也发现，在鼻咽癌细胞株6-10B中，使用Y-27632去抑制ROCK1的表达，随着抑制剂浓度的增加，鼻咽癌细胞株的细胞侵袭性减弱，差异有统计学意义。提示ROCK1蛋白与鼻咽癌的侵袭性相关。

总之，本研究的结果表明，ROCK1基因在鼻咽癌组织和细胞株中均高表达，揭示ROCK1与鼻咽癌的发展相关。本研究为今后的临床治疗和靶标药物的开发提供了理论基础。

图1 ROCK1在鼻咽癌和癌旁组织的表达：A为鼻咽癌组织，B为癌旁组织(免疫组织化学染色×100)