基于CD133及上皮-间质转化相关因子的列线图模型对上皮性卵巢癌预后的预测价值

张娟娟，张春莲，张志军，王超云

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)是妇科常见恶性肿瘤，国内报道显示其发病率及病死率均呈上升趋势[1-2]。由于该疾病起病隐匿，早期症状不典型，多数病人确诊时已为晚期，即便接受标准化的治疗方案，病人预后仍不理想[3]。早期预测病人预后，制定针对性的治疗方案，有助于改善病人结局[4]。肿瘤干细胞是肿瘤组织中具备自我更新、无限增殖、成瘤能力强，且可影响肿瘤侵袭、转移及抗放化疗的细胞[5]；上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可使肿瘤细胞摆脱细胞间粘附，从而提升其侵袭能力[6]。CD133蛋白是肿瘤干细胞重要标志物，Snail、E-cadherin蛋白是反应EMT的重要标志物，已有研究证实上述蛋白与EOC病人预后具有一定的相关性[7-8]，但目前尚缺乏能够具体预测病人术后生存情况的模型。因此，本研究利用Cox风险比例模型、R语言构建病人术后生存情况的列线图模型，有助于解决上述问题，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2009年1月至2012年1月于十堰市太和医院接受治疗的152例EOC病人为对象，进行持续随访研究，随访截至病人死亡或至2017年10月，随访时间为6～103个月。病人年龄范围为27～82岁，年龄(58.45±12.17)岁，其中<55岁78例，≥55岁74例；组织学分型：浆液性癌107例、黏液性癌24例、宫内膜样癌12例、透明细胞癌9例；国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)手术病理分期[9]Ⅰ～Ⅱ期74例、Ⅲ～Ⅳ期78例；肿瘤最长直径≥5 cm者56例、<5 cm者96例；伴腹部脏器或淋巴结转移者56例；伴腹水者53例。

1.2 纳入标准 术后病理确诊为上皮性卵巢癌；初治病人，均选择肿瘤细胞减灭术治疗，术后接受以铂类为主的联合化疗；病理、临床及随访资料完整；本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病人及近亲属知情同意。

1.3 排除标准 既往已接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗者；随访期间失访者。

1.4 方法

1.4.1 实验室检测 试剂：鼠抗人CD133单克隆抗体，兔抗人Snail多克隆抗体，购自美国Abcam；鼠抗人E-cadherin多克隆抗体、DAB显色试剂盒、ElivisionTMplus试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。方法：收集所有对象存档的手术标本石蜡块，4 μm连续切片、烤干，脱蜡至水洗后参考试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，选用已知阳性切片为阳性对照，以PBS代替一抗为空白对照。结果判定：由3名病理医师采用多数法独立双盲阅片判断免疫组织化学染色结果。CD133、E-cadherin蛋白阳性以细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒为准，Snail阳性以细胞核出现棕黄色颗粒为准，表达结果从着色强度和范围两方面综合计分。着色强度：0、1、2、3分分别表示无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色；着色范围：1、2、3、4分分别表示高倍镜下阳性细胞占比<10%、11%～50%、51%～75%、>75%，两者得分乘积为最终得分，积分≤2分为标本阴性，>2分为阳性。每个标本随机计数10个×400倍视野，取中位值进行判定。

1.4.2 观察指标 统计病人年龄、FIGO 手术病理分期、组织学分型、肿瘤直径、转移及腹水情况。采用电话、门诊复查及上门随访等方式对病人进行持续随访，观察病人生存情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0及R语言3.4.2版进行数据统计分析。单因素分析采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rankχ2检验进行单因素分析，采用Cox风险比例模型进行多因素分析，以明确病人累积生存率的影响因素，自变量筛选方案选择条件参数估计似然比检验，进入标准P<0.05，删除标准P>0.10。根据上述影响因素的回归系数等信息，利用R语言构建累积生存率的列线图模型和校准曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD133、E-cadherin、Snail表达情况 152份病理标本中，CD133阳性表达87例，占57.24%(87/152)，E-cadherin阳性表达50例，占32.89%(50/152)，Snail阳性表达89例，占58.55%(89/152)。

2.2 CD133、E-cadherin、Snail表达与累积生存情况的关系 病人中位生存时间51月(95%CI：44.637～57.363月)，1年、3年、5年累积生存率分别为93.4%、63.3%、37.5%。CD133、Snail阳性者，累积生存时间明显短于对应阴性者(Log-rankχ2=25.762，P<0.001；Log-rankχ2=16.463，P<0.001)，E-cadherin阴性者，累积生存时间明显短于阳性者(Log-rankχ2=37.159，P<0.001)，见图1。

2.3 累积生存率的影响因素分析 经Log-rankχ2检验，除CD133、E-cadherin、Snail表达情况外，FIGO分型Ⅲ～Ⅳ期、伴腹部脏器或淋巴结转移病人累积生存时间也分别明显短于FIGO分型Ⅰ～Ⅱ期、不伴腹部脏器或淋巴结转移病人(Log-rankχ2=7.373，P=0.007；Log-rankχ2=31.023，P<0.001)，而年龄、组织学分型、肿瘤最长直径、腹水均与累积生存时间无明显关系(P>0.05)。将CD133、E-cadherin、Snail、FIGO分型、腹部脏器或淋巴结转移作为自变量，按如下方案赋值：CD133、E-cadherin、Snail阳性为1，阴性为0，FIGO分型Ⅰ～Ⅱ期为1，Ⅲ～Ⅳ期为2，有伴腹部脏器或淋巴结转移为1，无为0，将累积生存情况纳为因变量，经Cox风险比例模型分析显示，CD133阳性、伴腹部脏器或淋巴结转移是影响病人预后的危险因素，E-cadherin阳性是影响病人预后的保护因素(P<0.05)，见表1。

图1 CD133、E-cadherin、Snail表达与上皮性卵巢癌累积生存情况的关系：A为总体情况；B为CD133与累计生存情况的关系；C为E-cadherin与累计生存情况的关系；D为Snail与累计生存情况的关系

指标β值标准误Waldχ2值P值HR(95%CI)CD133阳性 0.5600.2276.1060.0131.751(1.123～2.730)E-cadherin阳性-0.9050.22216.5780.0000.405(0.262～0.625)伴腹部脏器或淋巴结转移0.4200.2143.8540.0501.523(1.001～2.317)

2.4 病人预后的预测列线图模型建立 根据Cox风险比例模型分析结果，建立基于CD133、E-cadherin是否阳性及有无伴腹部脏器或淋巴结转移的列线图模型用于预测病人1年、3年、5年生存率，如图2。

列线图预测值的实例：某病人CD133、E-cadherin均阳性，伴腹腔脏器转移，则该病人的总评分为：64+0+44=108分，对应的术后1年生存率高于95%，3年生存率约为69%，5年生存率低于50%。

2.5 列线图模型验证 经内部验证，该模型一致性参数C-index=0.699，校准图形接近于斜率为1的直线，提示列线图较准确地预测病人术后死亡风险。见图3。

3 讨论

肿瘤组织中多数细胞增殖能力有限，数次分裂后就会死亡，但小群细胞具备无限增殖和分化的潜能，这是肿瘤形成、侵袭和转移的重要基础，此类细胞即肿瘤干细胞[10]。CD133可以作为卵巢癌肿瘤干细胞标志物[11]，其高表达多与FIGO高分期、肿瘤转移有关[12]，据文献报道，联合CD133检测对EOC病人的早期诊断、治疗及预后可能有参考价值[13]。本研究CD133阳性可明显缩短病人累积生存时间，提示肿瘤干细胞水平与病人预后存在一定的相关性。EMT具有细胞极性消失、黏附力下降、细胞骨架重塑，且获得间充质细胞迁移、侵袭及抗凋亡的生物学特性，肿瘤细胞出现EMT变化，则能够获得干细胞特性[14]。EMT过程受不同生长因子和信号通路转导信号共同调节，相关研究提示Snail/E-cadherin信号通路与EMT密切相关[15]：E-cadherin是广泛存在于上皮组织的钙依赖性细胞粘附分子；Snail能够与其启动子区域含有CAGGTG核心碱基序列的E-box元件结合，从而抑制E-cadherin表达，导致细胞粘附下降，肿瘤细胞易脱落并转移。Zhang等[16]发现高Snail表达、低E-cadherin表达多与FIGO高分期、肿瘤转移有关。本研究证实Snail阳性表达者及E-cadherin阴性表达者，其累积生存时间明显缩短，提示EMT与病人预后有一定相关性。已有研究证实发生EMT的细胞能够促使肿瘤干细胞亚群数量提升，从而使肿瘤细胞获得干性，同时，肿瘤干细胞又具备间质样细胞的特点，能够表达EMT相关因子，促进EOC肿瘤干细胞的干性特征产生及CD133表达，从而导致肿瘤的侵袭性增强，严重影响病人预后[17]。

图2 根据上皮性卵巢癌病人预后影响因素建立的列线图模型

图3 列线图预测上皮性卵巢癌病人累积生存率的校准曲线

Cox风险比例模型指出仅CD133、E-cadherin表达及是否伴腹部脏器或淋巴结转移与病人预后相关，其剔除了Snail表达情况，可能因后者对病人预后的影响被其它因素掩盖所致。目前对EOC病人预后影响因素的测评，主要基于Cox回归模型[18-19]，虽有一定指导价值，但难以为个体病人提供准确、具体的生存率信息，仍不能满足临床需求。本研究利用Cox回归分析结果，结合R语言，构建预测病人生存率的列线图模型，结果显示其具备良好的内部一致性和预测效能，可能能够为日后开展同类研究提供参考，即构建列线图模型有助于为病人提供个体化的生存率预测信息，这与其他肿瘤报道[20-21]结论一致。

综上，CD133及E-cadherin表达情况是EOC病人预后的影响因素，构建列线图能够有效预测病人生存率。从发展前景来看，CD133及E-cadherin联合检测有可能成为评估EOC病人临床预后的重要参考指标，有必要在严格设计的大样本、多中心研究中进一步验证。