新型槲皮素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究

周芳，杨扬，郭举

槲皮素(Quercetin)(图1)是一种广泛存在于植物及食物中的黄酮类化合物，呈黄色粉末状固体，通常含有两分子结晶水，弱酸性。文献研究表明，槲皮素具有抗氧化作用、抗肿瘤作用、抗炎症作用、降血糖等多种生物活性，具有很高的药用价值[1-6]。

图1 槲皮素的化学结构

近年来，槲皮素对癌症的化学预防和治疗作用逐渐被人们所认识并引起广泛的重视。研究表明，槲皮素能全面地作用于癌发生的始发、促癌和演进三个阶段，兼有抗致癌、抗促癌和诱导分化的作用[7]。对人白血病细胞、结肠癌细胞、骨髓瘤细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴瘤细胞、膀胱癌细胞等均有一定的抑制作用[8-11]。槲皮素通过改变细胞色素p4501A1(CYP1A1)等代谢酶的基因表达和活性，抑制致癌物的活化，或通过抑制环加氧酶-2(COX-2)的mRNA和蛋白质水平，从而减轻细胞损伤和癌变，对癌症发生具有预防作用。此外，在对癌症的治疗方面，槲皮素具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤细胞周期、干扰肿瘤细胞的信号传导通道、作用于雌激素受体、抑制肿瘤的血管生成，抑制肿瘤生长、转移、增强抗癌药物对肿瘤细胞的敏感性、逆转抗癌药物的耐药性等作用[12-14]。目前国内外课题组从事槲皮素衍生物的研究很多[15-16]，如贾景景等[17]将烯丙基和异戊烯基的引入槲皮素得到了一系列具有抗肿瘤活性的衍生物，Jian Yuan等[18]将甲基引入槲皮素得到一系列具有抗肿瘤活性的衍生物，但关于针对槲皮素特定位置羟基衍生化的文献报道的并不多，据此，我们设计合成了一系列新型的槲皮素衍生物5C1-5C7(图2)，这为后续槲皮素衍生物的合成研究以及获得具有更好抗肿瘤活性的先导化合物奠定了基础。

本研究的起止时间为2016年3月至2017年6月。

1 材料与方法

1.1 实验仪器1H-NMR：Bruker AVANCEⅢ 400M NMR,瑞士布鲁克科技有限公司；双目显微熔点仪(表显)：XT-4型(温度计未校正)，北京泰克仪器有限公司；三用紫外分析仪：MQK-ZF-1，上海米青科实业有限公司；恒温磁力搅拌器：CJB-S型，西安安泰仪器科技有限公司；循环水式多用真空泵：2XZ型，上海精密仪器仪表有限公司；旋转蒸发器：RE-3000型，西安安泰仪器科技有限公司；电热鼓风干燥箱：CN841-640L型，吴江市超能电热设备有限公司。

1.2 实验试剂 槲皮素：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；溴化苄：国药集团化学试剂有限公司；取代芳香丙烯酸：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；二碳酸二叔丁酯：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；N,N′-二环己基碳二亚胺 (DCC)：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；4-二甲氨基吡啶(DMAP)：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；钯碳(Pd-C)：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；四氢呋喃：加金属钠回流变蓝供用；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、二氯甲烷(CH2Cl2)：重蒸且无水处理；硅胶G和H：青岛海洋化工厂，未经活化；MTT法所需肿瘤细胞：中科院上海细胞库。所用试剂和溶剂均为化学纯或分析纯，除特别注明外，未经进一步处理。

1.3 化学合成实验

1.3.1 3,7,4′-三苄基槲皮素(2)的合成 称取槲皮素5.02 g，以100 mL DMF溶解，加入无水碳酸钾7.18 g，置于冰浴搅拌约15 min。取溴化苄8.2 mL加入反应液中，Ar保护，反应24 h以上。反应完毕，用适量水稀释反应液，乙酸乙酯萃取，合并有机层，以水洗有机层，无水硫酸钠干燥溶剂，旋干得红棕色油状物。粗产品经硅胶柱层析，以CH2Cl2为洗脱剂，得淡黄色针状固体(2)4.67 g，收率55%，熔点155～156℃(文献参考值[1]为150～152 ℃)[19-20]。1.3.2 3,7,4′-三苄基槲皮素-3′-芳香丙烯酸酯(4B1-4B7)合成通法 称取3,7,4′-三苄基槲皮素(2)10 mmol和取代芳香丙烯酸(3A1-3A7)10 mmol，以适量无水CH2Cl2溶解，冰浴，DCC 10 mmol和DMAP 12 mmol以无水CH2Cl2溶解加入反应体系，Ar保护，低温反应30 min，自然升温至室温反应过夜。以薄层色谱显色法(TLC)监测反应进行。反应完毕，收集滤液，旋干溶剂，以CH2Cl2-CH3OH重结晶得黄色沉淀(4B1-4B7)，收率70%～85%。

图2 槲皮素3′-芳香丙烯酯目标化合物的合成路线

1.3.3 槲皮素-3′-芳香丙烯酸酯(5C1-5C7)合成通法 称取3,7,4′-三苄基槲皮素-3′-芳香丙烯酸酯(4B1-4B7)5 mmol，以适量四氢呋喃和无水乙醇溶解，加入20%钯碳0.5 mmol，密封真空后，通入氢气，室温搅拌24 h。反应完毕，旋干溶剂，以CH2Cl2-石油醚重结晶得浅绿色粉末(5C1-5C7),收率81%～95%。

2 结果

2.1 结构表征 3,7,4′-三苄基槲皮素(2):1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):5.07(s,2H),5.13(s,2H),5.19(s,2H),6.44(d,J=2.0 Hz,1H),6.50(d,J=2.0 Hz,1H),6.95(d,J=6.0 Hz,1H),7.24-7.47(m,15H),7.61-7.64(m,2H),12.62(brs,1H)。

4B1:1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):4.93(s,2H),5.14(s,2H),5.17(s,2H),5.42(d,J=15 Hz,1H),6.44(d,J=2.4 Hz,1H),6.51(s,1H),6.53(d,J=2.4 Hz,1H),7.01(d,J=9.2 Hz,1H),7.21-7.56(m,19H),7.62(m,1H),7.77(d,J=2.0 Hz,1H),7.92(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H),12.64(brs,1H)。

4B2:1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):5.13(s,2H),5.15(s,2H),5.19(s,2H),5.57-5.52(d,J=15 Hz,1H),6.44(d,J=2.4 Hz,1H),6.54-6.56(d,J=6 Hz,1H),6.53(d,J=2.4 Hz,1H),7.01(d,J=9.2 Hz,1H),7.21-7.56(m,19H),7.62(m,1H),7.77(d,J=2.0 Hz,1H),7.92(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H),12.64(brs,1H)。

4B3:1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):2.42(s,3H),5.08(s,2H),5.11(s,2H),5.12(s,1H),5.13(s,2H),5.49(d,J=12 Hz,1H),6.44(d,J=2.0 Hz,1H),6.53(d,1H),7.02(d,J=8.8 Hz,1H),7.25-7.44(m,19H),7.78(d,J=2.0 Hz,1H),7.95(dd,J=8.8,1H),12.64(brs,1H)。

5C1:1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):5.13(s,1H),5.40(d,J= 15 Hz,1H),6.20(d,J=2.0 Hz,1H),6.45(d,J=2.0 Hz,1H),7.10(d,J=8.8 Hz,1H),7.32(d,J= 6 Hz,2H),7.34(d,J=6 Hz,2H),7.43(t,J=6.0 Hz,1H),7.87(d,J=2.0 Hz,1H),7.96(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H),9.65(brs,1H),10.50(brs,1H),10.87(brs,1H),12.43(brs,1H)。

5C2:1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):5.50-5.54(d,J=15Hz,2H),6.19(d,J=1.6 Hz,1H),6.41(d,J=1.6 Hz,1H),6.60(s,1H),7.08(d,J=8.4 Hz,1H),7.39(d,J=8.0 Hz,1H),7.62(s,1H),7.65(s,1H),7.69(m,2H),7.80(d,J=2.0 Hz,1H),7.96(dd,J=8.4,2.0 Hz,1H),9.57(s,1H),10.46(s,1H),10.81(s,1H),12.42(brs,1H)。

5C3:1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):2.45(s,3H),5.10(s,1H),5.50(d,J= 12 Hz,1H),6.22(d,J=2.0 Hz,1H),6.47(d,J=2.0 Hz,1H),6.94(s,1H),7.18(d,J=8.8 Hz,1H),7.36(s,1H),7.42(s,1H),7.40(s,1H),7.41(d,J=8.0 Hz,1H),7.81(d,J=2.0 Hz,1H),7.98(dd,J=8.4,2.0 Hz,1H),9.62(brs,1H),10.76(s,1H),10.97(brs,1H),12.45(brs,1H)。

2.2 抗肿瘤活性实验 选取了人结肠癌细胞系HCT-8，人肝癌细胞系BEL-7402，人胃腺癌细胞系BGC-823，人肺腺癌上皮细胞系A549，人卵巢癌细胞系A2780，人乳腺癌细胞系MX-1、MDA-MB-231等肿瘤细胞株，通过MTT法对槲皮素衍生物5C1-5C7的抗肿瘤活性进行了测试，经过3次平行测试，取平均值，结果显示如下。

表1 目标化合物对8种人肿瘤细胞的抑制活性/μM

注： IC50表示有50%的肿瘤细胞生长被抑制时的药物浓度；HCT-8(人结肠癌细胞系)，BEL-7402(人肝癌细胞系)，BGC-823(人胃腺癌细胞系)，A549(人肺腺癌上皮细胞系)，A2780(人卵巢癌细胞系)，MX-1、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞系)

3 讨论

本研究用不同取代的芳香丙烯酸与槲皮素3′位羟基进行缩合得到目标缩合物，并通过核磁共振波谱仪(1H-NMR)对目标化合物进行结构表征，同时对该类衍生物进行了体外细胞毒性试验的抗肿瘤活性测试，初步的活性结果显示该系列衍生物具有一定的抗肿瘤活性(表1)。通过对该系列槲皮素衍生物5C1-5C7(图2)体外抗肿瘤活性的测试结果可以看出，部分槲皮素衍生物对人结肠癌细胞系HCT-8和人乳腺癌细胞系MX-1、MDA-MB-231表现出了较好的抗肿瘤活性，尤其使目标化合物5C1和5C6对乳腺癌肿瘤细胞的IC50值达到了10微摩尔级，显示出了良好的体外抗乳腺癌活性，这为后续的槲皮素衍生物的合成研究以及获得具有潜在抗肿瘤活性的先导化合物提供了科学参考。