丁酸钠调控HepG2细胞的增殖、凋亡和侵袭

王英，吴庆柏，沈鹏，谢睿，季国忠，王宏刚

肝癌是人类较为常见的恶性肿瘤，在男性恶性肿瘤中死亡率排第二位，而在女性肿瘤病人中，死亡率排第六位[1]。2008年，全球约有75万新发肝癌病人，我国死亡者约占一半[2]。肝癌的早期诊断比较困难，血清中循环无细胞DNA联合分子标志物检测有助于提高诊断率[3]。目前肝癌的临床疗效有限，亟需寻找有效的靶向药物及新的作用靶点，改善病人预后。组蛋白去乙酰化酶(HDAC) 催化组蛋白发生去乙酰化，应用 HDAC 抑制剂可通过调控靶基因的转录，抑制肿瘤细胞发生发展。HDAC4 是属于Ⅱ 类 HDACs，可能与肿瘤发生发展有关。短链脂肪酸被认为是有效的 HDAC 抑制剂，调控多种癌细胞的生长、分化以及凋亡过程。丁酸钠(Sodium butyrate)是其中一种短链脂肪酸，可在肠道细菌分解纤维素时产生。丁酸钠在1978年[4]被发现有抑制 HDAC 作用，显示出潜在的抗肝癌作用[5]。丁酸钠 能导致多种肿瘤细胞如结肠癌、肝癌、乳腺癌细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，诱导肿瘤细胞分化[6-7]，其机制可能是通过使组蛋白过乙酰化而发挥生物学作用。笔者研究丁酸钠 对肝癌细胞HepG2的增殖、凋亡和细胞侵袭能力的影响，探讨可能的作用机制。

本研究起止时间为2013年3月至2015年9月。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 HepG2细胞系培养于含10%小牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中。将含培养液的细胞培养瓶置于含5% 二氧化碳的细胞培养箱培养。每24～36小时换液1次，待细胞长至约80%单层时，用0.25%胰酶溶液进行消化、传代，取生长良好的细胞进行实验。

1.2 细胞活力测定(MTT法) 取对数生长期细胞，制成1×106个/毫升单细胞悬液，接种于96孔板，每孔180 μL，随即加入不同浓度的丁酸钠溶液20 μL，使药物终浓度分别为0，0.5，1，2，5，10 mmol/L，每组设6个平行复孔，对照组加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，分别培养24 h，48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，继续孵育4 h后，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μL，震荡10 min，待结晶溶解后用酶标仪570 nm波长检测吸光度。

1.3 细胞周期和凋亡检测(流式细胞仪检测) 细胞培养于六孔板中，过夜贴壁，待细胞长至约80%时，用丁酸钠处理细胞，使药物终浓度分别为0，1，5，10 mmol/L，24 h后胰酶消化，收集细胞，PBS清洗细胞2次(1 000 r/min，5 min)，予100 μg/mL 核糖核酸酶(RNase)处理，50 μg/mL 碘化丙啶(PI)避光染色，流式细胞仪检测细胞周期。细胞凋亡按照Annexin V-FITC试剂盒操作说明进行操作，流式细胞仪检测。

1.4 细胞侵袭实验(Transwell侵袭实验) 将-20 ℃保存的Matrigel置于冰上过夜融化，制备稀释的含Matrigel液体，加入到Transwell上室，覆盖整个聚碳酸酯膜，置于细胞培养箱使Matrigel 聚合成凝胶。将已用不同浓度丁酸钠处理24 h的HepG2细胞接种于Transwell培养板上室，下室加入500 μL含10%小牛血清的培养液，培养24 h后，用棉签轻轻擦去上室Matrigel 凝胶和聚碳酸酯膜上表面的细胞。小心取出上室，用冰预冷的甲醇固定30 min，结晶紫染色1 min。小心将聚碳酸酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上，中性树脂封片。附着于聚碳酸酯膜下表面的细胞在显微镜下观察。将聚碳酸酯膜分为100个网格，按随机数字表法选取10个网格在高倍镜下(400倍)观察侵袭细胞并计数，取平均数。

1.5 免疫荧光实验 对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗涤后，予多聚甲醛固定细胞，再进行通透处理，通透后用PBS洗涤，使用封闭液对细胞进行封闭，抗体孵育4 ℃过夜。PST漂洗后加入二抗，室温避光孵育1 h，漂洗后封片，荧光显微镜检测。

1.6 蛋白质印迹法(Western Blot) 用PBS洗涤各组细胞3次，每孔加入蛋白裂解液，在冰上裂解30 min后，立即用细胞刮棒刮下细胞，4 ℃离心后取上清液，加入上样缓冲液，100 ℃水浴锅中变性。每组按50 μL蛋白上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用150 mA恒流转膜1 h至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，PBS漂洗后，加二抗室温孵育1 h，PBS漂冼。暗室内加入ECL发光液，X线片感光，显影，定影。

2 结果

2.1 丁酸钠抑制HepG2细胞的增殖能力 不同浓度(0.5、1、2、5、10 mmol/L)丁酸钠对 HepG2细胞的增殖能力的影响不同。低浓度(0.5 mmol/L) 丁酸钠处理 24 h后对细胞生长有轻微的促进作用。但随着丁酸钠浓度的增加(1、2、5、10 mmol/L)和处理时间的延长(24、48、72 h)，HepG2细胞呈现出明显的生长抑制状态(图1)。10 mmol/L丁酸钠处理HepG2细胞24、48和72 h后，活细胞百分比分别为64.3%、41.7%、9.1%，差异有统计学意义(F=212.8，P<0.001)。

图1 丁酸钠抑制HepG2细胞的增殖能力

2.2 丁酸钠影响HepG2细胞周期分布 不同浓度(0、1、5、10 mmol/L)丁酸钠 处理HepG2 细胞24 h后，流式细胞技术检测细胞周期。1 mmol/L 丁酸钠处理后，HepG2 细胞G1期细胞比例稍增加，S期细胞比例稍减少。但随着丁酸钠浓度的增加，细胞周期明显发生阻滞，G1期细胞比例明显增加，而S期细胞比例明显减少(图2)。0、1、5、10 mmol/L丁酸钠处理HepG2细胞24 h后，S期细胞比例分别为27.4%、29.1%、12.8%、10.5%，差异有统计学意义(F=33.7，P<0.001)。

2.3 丁酸钠诱导HepG2细胞凋亡 与对照组(0 mmol/L丁酸钠)相比，不同浓度(1，5，10 mmol/L)丁酸钠处理HepG2细胞24 h后，凋亡细胞百分比明显增加，早期凋亡率分别为2.7%，4.5%，6.5%，6.7%，差异有统计学意义(F=15.1，P=0.001)。这提示丁酸钠对HepG2细胞的促凋亡作用呈药物浓度依赖性(图3)。

图2 丁酸钠影响HepG2细胞周期分布:A为不同浓度(0，1，5，10 mmol/L)丁酸钠处理HepG2细胞24 h后，细胞周期的变化；B为丁酸钠处理后，细胞周期G1期、S期、G2期的量化

注：与对照组(0 mmol/L丁酸钠)相比，aP<0.05图3 丁酸钠诱导HepG2细胞凋亡：A为不同浓度(0，1，5，10 mmol/L)丁酸钠处理HepG2细胞24 h后，细胞凋亡增加；B为丁酸钠处理后，凋亡细胞百分比的量化

2.4 丁酸钠抑制HepG2细胞侵袭能力 本研究采用Transwell小室实验检测丁酸钠对肝癌细胞的侵袭能力。高浓度丁酸钠明显抑制了HepG2细胞的侵袭，并呈药物浓度依赖性(图4)。相对于0 mmol/L丁酸钠组，1、5、10 mmol/L丁酸钠组的侵袭细胞百分比分别降至72.7%、41.7%、21.3%，差异有统计学意义(F=202.1，P<0.001)。

2.5 HDAC4蛋白在HepG2细胞中的表达及定位应用免疫荧光法检测HDAC4蛋白的表达，发现HDAC4在HepG2细胞中表达阳性，细胞质和细胞核均有一定程度的表达，但主要位于细胞质(图5)。

2.6 丁酸钠显著抑制HDAC4蛋白表达 丁酸钠是一种HDAC抑制剂，可使组蛋白过乙酰化。不同浓度丁酸钠处理HepG2细胞后，Western Blot法检测HDAC4 蛋白的表达，发现随着处理浓度的增加，HDAC4表达显著减少(图6)。

图6 丁酸钠显著抑制HDAC4蛋白表达

3 讨论

HDAC4属于Ⅱ类 HDACs，与多种生物学过程有关，比如神经退行性疾病[8]，内分泌疾病[9-10]。组蛋白乙酰化过程与肿瘤的发生发展密切相关[11-12]。可以推测，HDAC4 的抑制剂可能对肝癌有治疗作用。丁酸钠作为一种去乙酰化酶抑制剂，能够提高组蛋白乙酰化水平[13]。研究发现丁酸钠 能够抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞衰老和凋亡等，这可能与其提高组蛋白乙酰化有关。丁酸钠已经应用于肿瘤的临床研究，现已广泛用于畜禽饲料添加。丁酸钠能抑制大部分HDACs，除了Ⅲ类HDACs和 HDAC6、HDAC10[14]。丁酸钠对多种肿瘤细胞均有抑制作用。丁酸钠可以诱导结肠癌、食管癌、肝癌、骨髓瘤等多种肿瘤细胞凋亡，尤其在消化系统肿瘤的诱导分化和凋亡成为近年研究热点。

本研究发现丁酸钠是一种具有HDAC4抑制剂活性的短链脂肪酸。丁酸钠能抑制HepG2肝癌细胞中HDAC4的表达。随着处理浓度的增加，丁酸钠明显抑制HepG2细胞生长增殖能力，调控细胞周期，促进HepG2细胞凋亡，抑制细胞侵袭能力，但其具体作用机制还不清楚。有学者认为组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin抑制了HDAC4的表达，从而抑制卵巢癌细胞的迁移[15]。研究认为HDAC4可能参与了肿瘤的侵袭和转移过程[16]。我们推测，丁酸钠可能通过抑制HDAC4而发挥作用。HDAC4属于Ⅱ类HDACs，主要表达于细胞质，但细胞核中也有，提示HDAC4在细胞质和细胞核之间可能存在信号传递的作用，有研发靶向HDAC4抗肿瘤药物的临床应用前景[17]。那么，丁酸钠是否通过抑制HDAC4而在基因水平调控肿瘤信号通路？我们下一步研究将构建HDAC4干扰载体，研究HDAC4下游的靶分子及其参与的信号途径，以进一步探讨肝癌的发生发展的机制。

总之，本研究认为丁酸钠抑制肝癌HepG2细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞侵袭能力。我们推测丁酸钠可能通过抑制HDAC4，靶向调控肝癌的进展，为研发新型化疗药提供依据。

图4 丁酸钠抑制HepG2细胞侵袭能力(0.1%结晶紫染色×100):A为0 mmol/L丁酸钠；B为1 mmol/L丁酸钠；C为5 mmol/L丁酸钠；D为10 mmol/L丁酸钠

注：绿色为HDAC4，蓝色为细胞核图5 HDAC4蛋白在HepG2细胞中的表达及定位(免疫荧光染色HDAC4，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色细胞核，×400)