诱导多能干细胞来源间充质干细胞对大鼠骨关节炎的治疗作用

何继晨，严君逸，程琢玉，程润，赵英杰，魏伟，严尚学

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种通常发生在中老年人身上的慢性关节疾病，表现为关节僵硬、持续性疼痛甚至残疾，并伴随不同程度的炎症和软骨缺损[1]。随着人口老龄化的加剧，OA的发病率逐年增高，已经发展成为突出的社会问题。OA是一种退行性疾病，目前尚无有效的治疗措施。临床上主要通过关节腔内注射润滑补充剂[2]或使用非甾体类药物、类固醇等缓解症状，减轻疼痛并控制炎症，以及在OA晚期运用关节置换等外科手术治疗方法[3]。然而这些方法只能暂时缓解病人疼痛和病情，并不能逆转软骨损伤和炎症进程[4]。采用细胞疗法修复和再生关节组织的结构和功能成为一种新的治疗选择。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能，能够分化成骨、软骨、脂肪、神经等多种成体细胞，而且还具有广泛的免疫调节特性，现已被应用于免疫和炎症性疾病[5-6]。骨髓源MSCs是最早研究的MSCs，但因其取材侵袭性强，体内数量有限等，已经逐渐被其他来源的MSCs所取代。人脐带来源的MSCs(human umbilical cord derived MSCs，hUC-MSCs)是MSCs的另一种重要细胞来源，因为其容易分离培养、低免疫原性和强大的体外扩增能力而被广泛运用。有研究发现，hUC-MSCs可抑制IL(白细胞介素)-1β诱导的炎症反应，并通过向软骨分化从而修复损伤的软骨组织[7]。诱导多能干细胞来源MSCs(induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)是将成熟体细胞制成单细胞悬液后加入特定转录因子重编程回到胚胎状态，然后在MSCs培养基中进行扩增并诱导分化成MSCs。iPSC-MSCs作为一种新型干细胞，比传统干细胞具有更有效、更可靠的再生能力，更容易从成人组织中通过重编程获得，并显示出更大的增殖潜能，可产生大量功能均一的MSCs[8]。有研究表明，iPSC-MSCs可诱导成骨分化，iPSC-MSCs来源的外泌体可促进血管生成，防止股骨头坏死等[9-10]；iPSC-MSCs移植可促进新西兰兔关节表面缺损处生成新的透明软骨[11]，也可通过旁分泌途径分泌一些因子抑制半胱氨天冬氨酸蛋白酶的裂解从而参与炎症调节过程[12]。iPSC-MSCs已经成为骨髓源、脐带源等MSCs和再生药物治疗OA的一种很有前途的替代细胞来源。尽管关于iPSC-MSCs治疗OA的研究很多，但是iPSC-MSCs的疗效、副作用及其作用机制仍有待进一步确认和深入研究。

基于iPSC-MSCs的优良特性和在软骨损伤方面的修复能力，本研究通过建立大鼠实验性骨关节动物模型，观察关节腔内注射iPSC-MSCs对OA大鼠的治疗作用并探讨其软骨保护作用机制。

本研究起止时间为2017年11月至2018年10月。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠50只，每只180～200 g，雌雄各半，由安徽医科大学动物实验中心提供[医学实验动物许可证号SYXK(皖)2017-006；合格证号No.34000200000978,2017-10]，自由饮食饮水。动物实验方案经安徽医科大学临床药理研究所实验动物伦理委员会批准(伦理号LLSC20170382)。

1.2 药品与试剂 iPSC-MSCs(批号NCIMP2018013101，4×108个细胞/毫升)和hUC-MSCs(批号NCMP2018013101，4×108个细胞/毫升)由安徽中盛溯源生物科技有限公司提供，给药前均经表型鉴定、计数和活力检查，细胞代次均为第3代。玻璃酸钠注射液(hyaluronate，HA)，25 mg∶2.5 mL，上海景峰制药有限公司产品(批号20171013)。抗MMP-13多克隆抗体(ab39012)、抗CollagenⅡ(ab34712)多克隆抗体、抗ADAMTS-5多克隆抗体(ab41037)为Abcam公司产品。

1.3 OA模型的建立 采用Hulth法建立大鼠OA模型，造模前大鼠禁食12 h。用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位置于手术台上，常规备皮消毒右侧后肢膝关节，从髌骨旁内侧切开暴露膝关节，然后切断内侧副韧带，打开关节腔；随后，切除前交叉韧带和后交叉韧带，行抽屉实验确定前后交叉韧带是否被切断；切除内侧半月板。术中确保关节面无损伤。最后，彻底止血后缝合切口，假手术组除了不切断前交叉韧带、后交叉韧带和内侧副韧带、半月板外，其余处理均同模型大鼠。术后不予固定手术侧膝关节，同时，所有大鼠每天肌内注射20万单位青霉素预防感染，持续3 d。术后1周以后，每天用小动物转棒仪对各组大鼠进行运动训练，以加重OA大鼠患肢负重[13]。

1.4 实验分组和给药方案 术后第12周，编号后，运用Excel表格随机分组功能，将模型大鼠随机分为4组：模型组、iPSC-MSCs组(2.0×106个细胞/只)、hUC-MSCs组(2.0×106个细胞/只) 和HA组(10 mg/mL)。另设假手术组作为对照。每组10只。iPSC-MSCs组和hUC-MSCs组每只大鼠一次性在术侧关节腔注射50 μL细胞；HA组大鼠每周一次关节腔注射50 μL HA，共5次；假手术组大鼠同法注射50 μL磷酸盐缓冲液。所有大鼠于给药5周后处死。

1.5 指标检测

1.5.1 关节直径差值检测 术后每天观察大鼠的饮食和活动情况，并观察伤口愈合情况。每周测量和记录动物体质量，处死动物后用游标卡尺测量每只动物手术侧和对侧膝关节的直径，并计算两侧膝关节直径的差值。

1.5.2 X线检查 给药结束后1周，每组取4只大鼠以3%戊巴比妥钠麻醉，行X线检查大鼠手术侧膝关节，并从膝关节腔大小、骨质硬化、骨赘形成等方面变化按凯尔格伦-劳伦斯(Kellgren-Lawrence)分级标准[14]进行评分。

1.5.3 大鼠膝关节Pelletier评分 给药结束处死大鼠后，留取膝关节标本，在手术显微镜下暴露关节腔，观察股骨髁和胫骨平台关节面是否平整，并根据股骨内、外髁及胫骨平台等软骨表面退变情况按照Pelletier大体评分标准[15]进行评分，评分越高表示关节面软骨损伤越严重。

1.5.4 大鼠膝关节病理学检查 处死大鼠后，取股骨内髁关节面，经体积分数10%的甲醛溶液室温固定48 h，脱钙，石蜡纵向包埋，切片后HE染色。由独立观察者根据Mankin评分标准[16]对每只动物的软骨结构、软骨细胞数量及潮线完整度进行组织学评分，评分越高表示软骨结构破坏越严重。

1.5.5 膝关节软骨基质金属蛋白酶(MMP)-13、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-5的检测 采用免疫组织化学方法检测MMP-13、CollagenⅡ、ADAMTS-5在大鼠膝关节中的表达。大鼠膝关节经脱钙、石蜡纵向包埋切片后，分别用乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液和3%过氧化氢进行抗原修复并阻断内源性过氧化物的干扰，一抗孵育4 ℃过夜，3遍磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后滴加生物素二抗室温孵育25 min，染色、封片后在光镜下观察。染色结果用Image J软件分析量化。

2 结果

2.1 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节直径差值的影响 实验结果如图1所示，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠膝关节直径差值显著增大，提示手术侧膝关节直径显著增大、关节变形，OA模型诱导成功；与模型组相比，iPSC-MSCs、hUC-MSCs给药均可显著降低大鼠膝关节直径差值[(1.00±0.40)比(2.34±0.44),P<0.01]、[(1.33±0.41)比(2.34±0.44),P<0.020]，HA给药也有类似作用[(1.48±0.21)比(2.34±0.44),P<0.049]。

2.2 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节X线评分的影响 X线检查结果如表1所示。与假手术组相比，模型组大鼠出现明显的关节腔狭窄，部分形成可见的骨赘和骨质硬化，提示OA模型诱导成功；与模型组相比，iPSC-MSCs给药可降低大鼠膝关节X线评分等级和重度(3、4级)OA动物数量，改善关节腔结构、减少骨赘形成和骨质硬化作用。

表1 OA大鼠膝关节X线评分与模型组的比较/只

注：与模型组比较，aZ=2.381,P=0.029;bZ=2.205,P=0.029;cZ=1.517,P=0.200;dZ=0.168,P=0.114

2.3 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节Pelletier评分的影响 解剖动物膝关节可见，假手术组大鼠关节面光滑平整，形态结构正常，关节腔内未见明显的关节积液及滑膜增生。模型组大鼠关节磨损严重，软骨面粗糙，关节面色泽暗淡，部分动物出现软骨剥落，软骨下骨质暴露。图2结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠Pelletier评分显著增高；与模型组相比，给予iPSC-MSCs和hUC-MSCs均能显著降低Pelletier评分[(1.22±0.67)比(3.22±0.83),P<0.01]、[(2.00±0.71)比(3.22±0.83),P<0.01]，改善软骨损伤，且iPSC-MSCs降低Pelletier评分较hUC-MSCs[(1.22±0.67)比(2.00±0.71),P=0.021]和HA[(1.22±0.67)比(1.89±0.60),P=0.045]给药差异有统计学意义。

2.4 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节病理的影响 病理组织学检测结果及评分如图1所示，假手术组大鼠关节骨组织正常，软骨细胞分布均匀，排列规律整齐，4层结构清晰可见，潮线完整平滑。模型组大鼠软骨边缘部分缺损，软骨细胞排列紊乱，成簇分布，可见炎性细胞浸润和不规则裂隙深达辐射层，潮线漂移中断或出现多重潮线。相比于模型组，iPSC-MSCs给药可显著减轻关节软骨退变状况，减少炎性细胞浸润，改善关节病理[(5.50±1.29)比(1.75±0.50),P<0.01]。与hUC-MSCs组和阳性药HA组比较，iPSC-MSCs对软骨结构的改善和降低病理Mankin评分差异有统计学意义[(3.25±1.26)比(1.75±0.50),P=0.041]、[(4.00±0.82)比(1.75±0.50),P=0.004]。

2.5 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节中CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5表达的影响 免疫组织化学方法检测大鼠膝关节软骨中CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5含量，阳性结果为软骨细胞胞质内出现棕黄色染粒。结果如图2～4所示，与假手术组相比，模型组大鼠关节软骨中CollagenⅡ降解严重，表达显著减少[(66.97±2.82)比(35.87±8.52),P<0.01]；与模型组相比，iPSC-MSCs和hUC-MSCs给药组能显著增加软骨基质中CollagenⅡ表达[(35.87±8.52)比(69.90±7.65),P<0.01]、[(35.87±8.52)比(61.00±5.52),P<0.01]，阳性药HA组CollagenⅡ表达水平低于iPSC-MSCs组[(49.31±12.32)比(69.90±7.65),P=0.010]，提示iPSC-MSCs可减少OA软骨基质的破坏，保护软骨基质。检测MMP-13和ADAMTS-5结果显示，模型组大鼠关节软骨中MMP-13和ADAMTS-5表达显著高于假手术组[(59.25±5.56)比(21.50±4.51),P<0.01]、[(52.25±10.47)比(14.50±4.20),P<0.01]；各组给药均可显著降低模型大鼠膝关节软骨MMP-13和ADAMTS-5表达水平，其中iPSC-MSCs组MMP-13和ADAMTS-5的表达水平明显低于hUC-MSCs组[(33.75±5.85)比(43.25±6.02),P=0.028]、[(22.25±6.13)比(36.50±4.65),P=0.011]和HA组[(33.75±5.85)比(51.75±5.56),P<0.01]、[(22.25±6.13)比(40.75±5.56),P=0.001]，提示iPSC-MSCs可以下调关节软骨中MMP-13和ADAMTS-5表达，降低软骨基质降解酶的水平。

3 讨论

Hulth模型是研究OA的一种经典造模方法，通过切除内侧副韧带暴露大鼠关节腔，再切除内侧半月板和前后交叉韧带，破坏关节结构，导致关节应力失衡，增加关节间的摩擦，从而达到类似与人OA的病理改变。但由于动物术后的活动情况不一致等原因，模型成型率及OA严重度均不甚理想。为了提高模型的成型率，我们在动物手术1周后每天用小动物转棒仪对模型大鼠进行运动训练10 min，转速从慢到快，加速、加重患肢的负担，显著提高了OA大鼠模型的成型率和严重度。造模12周后，大鼠手术侧膝关节出现增粗、硬骨变形，X线检查结果显示手术侧关节腔变窄，骨赘形成，出现骨质硬化，提示OA大鼠造模成功，总体成模率达90%。

iPSCs是类似于胚胎干细胞的一种新型多能干细胞，可由病人自身的特定体细胞诱导，细胞质量可控，来源广泛，可以克服hUC-MSCs存在的伦理学、来源受限等问题，被认为是治疗各种组织损伤有希望的疗法[17-18]。本研究发现，iPSC-MSCs可显著降低大鼠手术侧和非手术侧膝关节直径差值，降低大鼠膝关节面Pelletier评分和X线评分，改善关节腔结构，减轻骨质硬化程度和骨赘等形成，提示iPSC-MSCs可缓解由于手术造成的关节不稳，对膝关节面之间摩擦而引起的骨质增生和硬化具有保护作用；iPSC-MSCs关节腔注射可减少软骨层缺损，改善潮线完整度并降低病理学评分，修复后的软骨具有与正常软骨相似的典型透明特征，提示iPSC-MSCs对OA大鼠具有明显的治疗作用，且在降低Pelletier评分、改善关节病理和软骨基质退变方面较上市制剂HA以及脐带源MSCs具有一定的优势。

细胞外基质及软骨下骨合成和降解的失衡是OA发生的重要机制。关节软骨基质中硫酸软骨素蛋白多糖(aggrecan)与糖胺多糖透明质酸形成巨大的聚集体，吸水后膨胀的聚集体受另一种软骨成分CollagenⅡ网的束缚，这种复合结构赋予软骨基质抗压强度及减震性能[19]。基质金属蛋白酶家族MMP-13是降解软骨细胞外基质的主要酶系，可以通过过度切割软骨基质中含量最多的CollagenⅡ，促进CollagenⅡ三螺旋结构的裂解膨胀[20]，在OA病人关节软骨中，MMP-13含量升高引起软骨基质网状Ⅱ型胶原结构被破坏，从而导致关节软骨缺损。Aggrecan是构成软骨基质的另一重要组成部分，可以保持软骨的弹性、含水量和结构完整性。解聚蛋白样金属蛋白酶家族中ADAMTS-5可以通过降解aggrecan，导致软骨结构完整性丧失和关节功能受损，其含量与OA疾病的严重程度呈正相关[21]。iPSC-MSCs关节腔注射可抑制基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达，并增加基质中CollagenⅡ的表达，提示iPSC-MSCs关节腔注射可以抑制软骨降解、促进Ⅱ型胶原形成，发挥软骨保护作用。

综上，iPSC-MSCs关节腔注射对大鼠OA具有明显的治疗作用，其机制与恢复软骨基质合成与降解的失衡有关。

注：a表示潮线，b表示软骨面缺损或平整性，c表示炎性细胞浸润，d表示软骨细胞；与假手术组相比，eP<0.01；与模型组相比，fP<0.05，gP<0.01；与iPSC-MSCs组相比，hP<0.05，iP<0.01图1 iPSC-MSCs对大鼠膝关节病理的影响：A为假手术组，B为模型组，C为iPSC-MSCs(2.0×106)组，D为hUC-MSCs(2.0×106)组，E为HA(10 mg/mL)组，A～E图均HE染色×100；F为各组大鼠膝关节病理Mankin评分

注：与假手术组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05,cP<0.01；与iPSC-MSCs组相比，dP<0.05 图2 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节CollagenⅡ表达的影响：A为假手术组，B为模型组，C为iPSC-MSCs(2.0×106)组，D为hUC-MSCs(2.0×106)组，E为HA(10 mg/mL)组，A～E图均免疫组织化学染色×100；F为各组大鼠膝关节CollagenⅡ表达

注：与假手术组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.01；与iPSC-MSCs组相比，cP<0.05，dP<0.01图3 iPSC-MSCs对OA大鼠膝关节MMP-13表达的影响：A为假手术组，B为模型组，C为iPSC-MSCs(2.0×106)组，D为hUC-MSCs(2.0×106)组，E为HA(10 mg/mL)组，A～E图均免疫组织化学染色×1 000；F为各组大鼠膝关节MMP-13表达

注：与假手术组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.01；与iPSC-MSCs组相比，cP<0.05，dP<0.01图4 MSCs对OA大鼠膝关节ADAMTS-5表达的影响：A为假手术组，B为模型组，C为iPSC-MSCs(2.0×106)组，D为hUC-MSCs(2.0×106)组，E为HA(10 mg/mL)组，A～E图均免疫组织化学染色×1 000；F为各组大鼠膝关节ADAMTS-5表达