康复新液抗念珠菌性阴道炎的药效研究△

杨亚超，苏刘艳，刘一丹，庄馨瑛，王睿睿，张祎*

1.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；2.云南省民族特色养生理论与健康产品工程实验室，云南 昆明 650500；3.昆明制药集团股份有限公司，云南 昆明 650500

真菌感染性疾病，尤其是浅部真菌感染，在我国属于常见病、多发病。其中念珠菌性阴道炎是一种常见的生殖道感染性疾病，其感染率可达11.8%。念珠菌性阴道炎，又称霉菌性阴道炎，其致病菌以白色念珠菌Candidaalbicans为主，占比多达80%～90%。白色念珠菌广泛存在于自然界中，其为条件致病菌，存在于正常人的皮肤、口腔及阴道中，但并不致病；当机体免疫力下降时，该菌就会大量繁殖并侵袭机体继而诱发系列疾病。近些年来，由于抗菌药的不规范使用[1]和激素、免疫抑制剂在临床上的大量应用[2]，导致机体菌群失调和免疫力降低，皮肤、黏膜、内脏等发生真菌感染的概率大幅增高，念珠菌性阴道炎的发病率也居高不下。

中医认为，念珠菌性阴道炎多因湿热生虫、虫蚀阴中所致，属外感湿浊秽毒之邪。其主要病因是脾气之虚、肝气之郁、湿气之浸、热气之逼、带脉之伤所致。此外，尚可因摄生不慎、洗浴用具不洁感染湿毒，直犯阴器，侵于任带二脉，致任脉不固，带脉失约，秽液下流而发。美洲大蠊为昆虫纲翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，在我国分布广泛，入药始载于《神农本草经》[3]，其功效为散瘀消结、解毒利尿，临床常外用治疗蛇虫咬伤、痈疮肿毒、脚气水肿、气喘、小便淋浊等症。生物学家发现，美洲大蠊进化史漫长，繁殖能力强，生活环境较为复杂，携带50多种致病或非致病菌，但自身却不被感染，说明其具有较强的抗菌性[4]。康复新液是美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物，有学者对其成分进行了分析，鉴定了十余个化合物[5]，发现其含氮化合物具有促创面愈合的活性[6]。有文献报道康复新液具有广谱抑菌、促细胞生长、镇痛、改善微循环、增强免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等作用[7]。

本研究拟通过体外实验检测康复新液对白色念珠菌的抗菌作用，通过复制念珠菌性阴道炎小鼠模型，进行康复新液抗念珠菌性阴道炎的初步药效学研究；以期为临床提供治疗念珠菌性阴道炎的候选药物，同时为开发利用美洲大蠊药用资源提供新的思路。

1 材料

1.1 药物

康复新液购自昆明赛诺制药股份有限公司，批号：17033022。氟康唑分散片购自南昌弘益药业有限公司，批号：171128。

1.2 供试菌种

白色念珠菌标准株ATCC10231购自中国科学院昆明植物研究所；23#临床耐药株由昆明医科大学第一附属医院皮肤科主任李玉叶教授赠送(由艾滋病患者体内提取分离培养，对唑类抗真菌药具有较强的耐药性)。供试菌种使用前接种到沙氏琼脂培养基上，37 ℃恒温培养24 h，备用。

1.3 动物

SPF级雌性Balb/c小鼠120只，4周龄，体质量18～22 g，购自昆明医科大学实验动物学部，动物合格证号：SCXK(滇)K2015-0002，饲养于云南中医药大学动物实验室。

1.4 主要仪器与试剂

连续波长酶标仪(SPECTRAMAX PLUS384型，Molecular Devices美谷分子仪器有限公司)，生物显微镜(E200MV型，南京尼康江南光学仪器有限公司)，恒温恒湿真菌培养箱(HWS-250BX型，天津市泰斯特仪器有限公司)。苯甲酸雌二醇(E2，江西博莱大药厂有限公司，批号：20180820，规格：1 mL∶1 mg)，环磷酰胺(CAYMAN CHEMICAL COMPANY，批号：0491131-9，规格：10 g)，沙氏琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司，批号：1073561，规格：250 g)，沙氏液体培养基(广东环凯微生物科技有限公司，批号：1069251，规格：250 g)，YPD琼脂培养基，无菌PBS(Phosphate Buffered Saline)，gibco[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司，生产批号：8117302，规格：500 mL]。

2 方法

2.1 康复新液抗白色念珠菌体外实验研究

采用微量稀释法，选用标准株ATCC10231和23#临床耐药株。实验前用沙氏液体培养基将供试菌种密度调为1×105个/mL。用沙氏液体培养基稀释康复新液原液，阳性药物氟康唑稀释成初质量浓度为1000 μg·mL-1，采用5倍倍比稀释6个浓度梯度的方式制备不同浓度的药物受试液。96孔板中依次加入100 μL不同浓度药液和100 μL菌悬液，并混合均匀。同时设定阳性对照组(只加培养液和菌液)、空白对照组(只加培养液不加菌液)及阳性药物对照组，临床用药以氟康唑最为广泛，且效果最佳，因此选用氟康唑为本实验阳性对照药物。每组重复3个复孔，37 ℃恒温培养24 h，全自动酶标仪检测625 nm波长处的吸光度(A)值，重复读取3次取平均值。按公式(1)(2)计算白色念珠菌的半数有效浓度EC50值，以此判断康复新液的抗菌抑菌作用。

(1)

半数抑菌浓度(EC50)=10[lg(c)+(a-50)/(a-b)×lg(1/5)]

(2)

式中：c为抑菌率大于50%对应上述梯度浓度中的最小浓度，a为c对应的抑菌率，b为仅小于a的抑菌率。

2.2 康复新液抗念珠菌性阴道炎实验研究

2.2.1 动物分组 小鼠适应性喂养1周，按随机数表法分为4组，每组30只，分别为对照组、真菌感染模型组、康复新液治疗组、氟康唑治疗组。实验前每只小鼠用无菌PBS阴道灌洗并将灌洗液进行培养，选择灌洗液培养皿中无白色念珠菌生长的小鼠用于正式实验。

2.2.2 模型复制及给药 参考夏德超等[8]和孔小锋等[9]模型复制方法并进行适度改良后建立白色念珠菌阴道感染小鼠模型。1)预处理：接种前4 d开始每鼠分别皮下注射E2(1 mg·mL-1)0.025 mL，1次/d，连续注射4 d，造成小鼠假发情，阴道扩张，之后每2 d注射1次，直至实验结束；接种前3 d开始每鼠腹腔注射环磷酰胺(100 mg·kg-1)10 mL·kg-1，1次/d，连续注射3 d，造成小鼠自身免疫缺陷，之后每3 d注射1次(75 mg·kg-1)10 mL·kg-1，直至实验结束。2)真菌接种：阴道接种前用无菌PBS将白色念珠菌标准株密度调为2.5×107个/mL，用微量加样器吸取菌悬液20 μL，注入模型组和治疗组小鼠的阴道内，原位停留1～2 min，防止菌液溢出；空白对照组阴道内注入20 μL无菌PBS。接种后的第2天、第4天和第7天，每组取3只小鼠用无菌PBS阴道灌洗，将灌洗液进行培养，评价念珠菌性阴道炎动物模型是否成功。3)给药：模型成功建立24 h后，康复新液治疗组阴道灌洗给予相应药液100 μL/只，氟康唑治疗组灌胃给药(2 mg·kg-1)，同时阴道灌洗无菌PBS 100 μL/只，对照组、模型组阴道灌洗无菌PBS 100 μL/只，连续给药7 d，每天按照检测指标评价抗菌活性。

2.2.3 指标检测

2.2.3.1 全身及阴道局部情况观察 每个灌洗日进行全身情况观察，记录小鼠体质量，并做阴道局部症状评分。评分标准为0分：外阴阴道无红肿及分泌物增多；1分：外阴阴道轻微红肿，无分泌物增多；2分：外阴阴道明显红肿伴分泌物增多；3分：外阴阴道明显红肿，出现溃疡，并伴分泌物增多；4分：死亡。

2.2.3.2 灌洗液镜检及菌落培养计数 每个灌洗日阴道用100 μL无菌PBS灌洗，灌洗液置于洁净无菌的EP管中，取10 μL灌洗液镜下观察菌丝生成情况；灌洗液用无菌PBS稀释10倍，取10 μL接种于YPD琼脂培养基，37 ℃培养24 h后，进行菌落观察并计数(Colony-Forming Units，CFU，即菌落形成单位，以个/mL为单位计数)。

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 康复新液体外对白色念珠菌的影响

按照2.1方法计算康复新液的半数有效浓度(EC50)值，以此判断康复新液的抗菌作用。实验结果表明，康复新液对白色念珠菌标准株有一定的抑制效果，半数有效浓度大约为康复新液原液2倍稀释浓度；康复新液对临床耐药株的抑制效果较好，半数有效浓度大约为康复新液原液6倍稀释浓度。阳性药物氟康唑对白色念珠菌标准株有良好的抑制效果，EC50为30.69 μg·mL-1；氟康唑对临床耐药株的EC50大于1000 μg·mL-1，无抑制效果，具体结果见表1。

表1 康复新液体外对白色念珠菌的抑制作用

3.2 康复新液抗念珠菌性阴道炎实验

3.2.1 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠一般情况的影响 实验结果表明，与对照组相比，真菌感染模型组小鼠行动呆滞、体表毛发均有脱毛呛毛现象；与真菌感染模型组相比，康复新液、氟康唑治疗组小鼠行动敏捷、毛发光滑、无脱毛呛毛现象，具体结果见图1。

3.2.2 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠体质量的影响 实验结果表明，与对照组相比，真菌感染模型组小鼠体质量整体呈下降趋势，造模第13天、第14天体质量明显下降(P<0.05)；与真菌感染模型组相比，康复新液治疗组小鼠给药第5天、第6天、第7天体质量显著上升(P<0.05)，氟康唑治疗组小鼠给药第3天、第5天、第6天、第7天体质量显著上升(P<0.05)，具体结果见图2。

3.2.3 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠外阴外观及阴道局部炎症的影响 实验结果表明，与对照组相比，真菌感染模型组小鼠接种白色念珠菌后第2天开始外阴红肿明显、分泌物明显增多，且在接种后第2天、第4天、第7～14天阴道炎症评分显著上升(P<0.01)；与真菌感染模型组相比，康复新液、氟康唑治疗组小鼠给药第5、6、7天外阴红肿缓解、分泌物减少、阴道局部炎症评分下降(P<0.01)，具体结果见图3～4。

3.2.4 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠阴道菌落的影响 实验结果表明，与对照组相比，真菌感染模型组小鼠阴道白色念珠菌定植菌落数显著增多(P<0.01)；康复新液、氟康唑治疗组与真菌感染模型组相比，小鼠阴道内白色念珠菌定植明显减少，灌洗液培养菌落数明显减少(P<0.01)，具体结果见图5～6。

图1 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠一般情况的影响

注：与对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。图2 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠体质量的影响

图3 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠外阴外观的影响

注：各时间点部分分组内3只小鼠阴道炎症评分相同，故统计学标准差为0；第0天各组炎症评分均为0，第2天、第12天、第13天、第14天对照组炎症评分为0，第14天康复新液、氟康唑组炎症评分为0，故图中不予显示。图4 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠阴道局部炎症的影响

图5 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠阴道菌落定植情况的影响

图6 康复新液对念珠菌性阴道炎模型小鼠阴道定植菌落数的影响

4 讨论

中医认为念珠菌性阴道炎患者多为素有肝经湿热，或肝郁脾虚、化热生湿，久则湿热之邪化为湿毒并随经下注，蕴结阴器，又湿热蕴积生虫发为阴痒，甚则灼痛，带下异常或伴心烦不寐，胸闷不适，口苦而腻，纳谷不香等，舌质红、苔黄腻，脉玄数或滑数。运用中医药思维，寻找相应中药及复方用来预防和治疗阴道炎疾病具有很好的发展前景。

目前治疗念珠菌性阴道炎的药物如甲硝唑、环丙沙星等，微生态治疗制剂如地衣芽孢杆菌，还有中药洗剂如苦参洗剂等，不过存在可诱发耐药性、复发率高、用药不便、制剂困难等不足。因此，寻找更加安全、有效的治疗药物具有重要意义。目前可供临床选择的治疗念珠菌性阴道炎的药物主要有两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑、依曲康唑等几种药物，其中氟康唑因其良好的生物利用度和较少的不良反应，成为临床应用最广泛的抗真菌药物[10]；但在长期治疗和重复给药过程中，诱使白色念珠菌快速产生耐药性，导致氟康唑耐药程度越来越严重，而且大部分耐氟康唑真菌对其他抗真菌药物具有交叉耐药性，使得目前的抗真菌药物对越来越多的耐药菌束手无策，这是导致临床治疗失败的主要原因。鉴于目前临床抗真菌用药选择范围小、不良反应大、耐药性产生以及临床治疗失败等原因，寻找新的抗菌谱广、抗菌效果好、不良反应小的中药制剂已经成为临床抗真菌治疗的发展方向之一。

康复新液属于纯天然昆虫提取物，与传统化学药相比，来源丰富、药用价值高、不良反应低、安全性高、使用方便，不易产生耐药性[11-12]，且康复新液具有广泛抑菌、抗真菌、抗病毒、促生长、镇痛、改善微循环、增强免疫、抗肿瘤的作用。研究康复新液对阴道炎菌群的抑制或杀灭作用不仅为开发利用美洲大蠊药用资源提供了新的思路，也为临床上治疗念珠菌性阴道炎提供了新的候选药物，减少广大女性患者的痛楚。本研究对于合理、持续地开发利用美洲大蠊这一天然药物资源具有重要的意义。

近年来对康复新液的研究越来越多，其药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，主要用于胃、十二指肠溃疡、褥疮、外伤、烧伤、烫伤等疾病的治疗。康复新液是美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物，其作为一种十分古老的昆虫，是传统的中药材[13]，味咸、性寒；治血瘀症、寒热、破积聚、喉咽痹、内寒无子[14]，常以干燥或鲜成虫入药，药用历史悠久[15]。研究发现康复新液在临床皮肤科、鼻科、外科、妇科和口腔科的疾病治疗中取得了新进展[11]，拓宽了康复新液的适应症范围，提升了康复新液的药用价值。目前国内学者侧重于美洲大蠊提取物药用价值的开发和临床应用[16]，国外学者则偏重于各种化学成分的提取、鉴定、基因表达及分子生物学研究[17]。

本研究通过体外抑菌实验简便快捷地确认康复新液具有抗白色念珠菌标准株和23#临床耐药株作用，进而联合体内动物实验，以标准株感染小鼠阴道，造成稳定的念珠菌性阴道炎动物模型，进一步确证了康复新液抗白色念珠菌标准株作用。虽有研究证明康复新液对白色念珠菌具有抑制作用[7，18]，但是目前并未有报道明确表明康复新液抗白色念珠菌临床耐药株及其作用机制。后续将以临床耐药株为主要菌株，进一步确证康复新液抗临床耐药株作用。