两色金鸡菊总黄酮部位多指标成分含量测定△

于凡，宋颜君，孙晓媛，许利嘉*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室，北京 100193

两色金鸡菊CoreopsistinctoriaNutt.系菊科金鸡菊属的头状花序。原产于北美，现在已分布世界各地，过去的几十年在新疆的高原地区(3000 m以上)广泛栽培[1-2]，以和田地区质量为佳，又称昆仑雪菊[3]。《新华本草纲要》记载，蛇目菊具有清热解毒、活血化瘀之功效，主治燥热烦渴等病症。在葡萄牙，两色金鸡菊被称为“Estrelas-do-Egipto”，有用于控制糖尿病的传统应用[4]。维吾尔人用两色金鸡菊头状花序作为草药茶来治疗高血压和腹泻。

两色金鸡菊主要含有黄酮类、苯丙素类、萜类、生物碱、糖类、皂苷类等化合物，研究表明，黄酮类成分是两色金鸡菊主要的药理活性成分，质量分数高达18.3%[5]。两色金鸡菊的药理研究也多是针对其黄酮部位的研究，现代药理研究表明，两色金鸡菊富含黄酮类，可以调节血糖、血脂和血压[6-8]。目前虽有对两色金鸡菊粗提物进行含量测定的研究[9-11]，但多是对5～8个化合物建立含量测定方法，缺乏系统研究，且对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、圣草酚及紫铆花素尚缺乏含量测定报道。通过超高效液相方法建立了两色金鸡菊10种成分含量测定方法，为其质量控制提供参考和依据。

1 材料

1.1 仪器

赛默飞ScientificTMDionexTMUltiMateTM3000 DAD液相色谱；Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

超纯水(Millipore公司，美国)；甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher公司)；乙醇、甲醇(分析纯，北京化学试剂公司)；甲酸(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；大孔树脂HP-20(安徽三星树脂科技有限公司)；马里苷(永健医药，批号：102027)；奥卡宁(永健医药，批号：101932)；2R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷(永健医药，批号：101952)；圣草酚(永健医药，批号：102151)；槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷(永健医药，批号：102099)；对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(永健医药，批号：102019)；槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(永健医药，批号：101966)；异奥卡宁(永健医药，批号：102056)；金鸡菊苷(永健医药，批号：102039)；紫铆花素(永健医药，批号：102166)。两色金鸡菊购自新疆地区，经中国医学科学院药用植物研究所陈四保研究员鉴定为两色金鸡菊。

2 方法与结果

2.1 两色金鸡菊总黄酮的制备

干燥两色金鸡菊头状花序100 kg，经80%甲醇浸泡，回流提取3次。减压浓缩成水溶液80 L。经大孔树脂HP-20柱层析，采用乙醇水梯度洗脱，其中70%乙醇洗脱的部分，减压浓缩成浸膏405 g。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取10种对照品，置1 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容至刻度，混匀，得到各对照品的储备液。将各对照品的储备液各取适量后，置于5 mL容量瓶中，混匀，并用80%甲醇定容至刻度，混匀后得混合对照品的储备液。混合对照品的储备液中，各对照品质量浓度分别为：2R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)4.11 mg·mL-1、对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)0.184 mg·mL-1、槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷(3)1.55 mg·mL-1、异奥卡宁(4)1.019 mg·mL-1、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(5)0.405 mg·mL-1、马里苷(6)2.576 mg·mL-1、金鸡菊查尔酮(7)0.127 mg·mL-1、奥卡宁(8)1.083 mg·mL-1、圣草酚(9)0.151 mg·mL-1、紫铆花素(10)0.188 mg·mL-1。对照品溶液均储存在4 ℃。

2.3 供试品溶液的制备

取两色金鸡菊浸膏，精密称取粉末约50 mg于5 mL的容量瓶中，精密加入相应体积的80%甲醇至近刻度，超声提取40 min，放置室温，用80%甲醇定容至刻度，0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.4 UPLC分析条件

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相为0.1%甲酸水(B)和乙腈(C)，梯度洗脱，洗脱程序为：0～1 min，95%B；1～2 min，95%～90%B；2～6 min，90%B；6～9 min，90%～88%B；9～15 min，88%～85%B；15～18 min，85%B；18～25 min，85%～80%B；25～31 min，80%～78%B；31～36 min，78%～60%B；36～42 min，60%B。流速为0.3 mL·min-1；柱温为30 ℃；紫外检测波长为285、378 nm；进样体积为3 μL。其中化合物3、5、6、7、8、10的紫外检测波长选择响应值较高的378 nm。采用赛默飞Scientific Dionex Chromeleon软件采集数据并分析。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 取混合对照品储备溶液，加80%甲醇梯度稀释成不同浓度的混合对照品溶液，取3 μL进样分析。以峰面积值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。结果表明，各对照品在线性范围内线性关系良好。

注：1.2R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷；2.对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；3.槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷；4.异奥卡宁；5.槲皮素-7-O-葡萄糖苷；6.马里苷；7.金鸡菊查尔酮；8.奥卡宁；9.圣草酚；10.紫铆花素。图1 10种对照品的UPLC图

2.5.2 最小检测限和最小定量限 将各对照品储备液多次稀释，进行分析，得到各对照品的最小检测限(LOD)和最小定量限(LOQ)。最小检测限和最小定量限定义为信噪比分别等于3(S/N=3)和10(S/N=10)时对应的对照品浓度，结果见表1。

2.5.3 精密度试验 取同一份样品溶液，连续进样6次，按2.4项下色谱条件测定，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果相对保留时间RSD<1.12%，相对峰面积RSD<2.97%，表明精密度良好。结果见表1。

2.5.4 稳定性试验 取同一份样品溶液，分别在配置后的0、2、4、8、12、24 h测定，以峰面积的平均标准偏差为指标评价样品的稳定性，10种对照品的RSD均小于3.77%。，相对保留时间RSD<0.32%，结果表明样品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 重复性试验 取样品6份，按2.3项下供试品溶液方法制备，按2.4项下色谱条件测定各对照品的含量，RSD值分别为：1.75%(1)、2.71%(2)、2.51%(3)、2.18%(4)、3.33%(5)、1.66%(6)、1.77%(7)、1.80%(8)、1.76%(9)、1.76%(10)。表明此方法的重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取样品9份，每份约50 mg，精密称定，分别按高、中、低含量加入10种对照品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件测定峰面积，回收率的测定结果见表2。回收率范围在97.38%～101.26%，表明该方法有良好的准确度。

表1 两色金鸡菊总黄酮10种成分的线性回归分析与精密度试验

表2 两色金鸡菊总黄酮10种成分的加样回收率试验(n=9)

2.6 两色金鸡菊中10种成分含量测定

分别精密称取3份样品，约50 mg，按照2.3项下供试品溶液的制备方法进行处理，按照2.4项下所建立的分析方法进行测定，计算各样品中10种成分的含量，含量测定结果见表3。

注：1.2R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷；2.对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；3.槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷；4.异奥卡宁；5.槲皮素-7-O-葡萄糖苷；6.马里苷；7.金鸡菊查尔酮；8.奥卡宁；9.圣草酚；10.紫铆花素。图2 两色金鸡菊总黄酮部位的UPLC图

化合物质量分数12R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷278.002对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷8.043槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷51.304异奥卡宁64.805槲皮素-7-O-葡萄糖苷11.106马里苷230.007金鸡菊查尔酮7.548奥卡宁48.409圣草酚6.0710紫铆花素2.78

3 讨论

两色金鸡菊作为茶饮在我国民间被长期应用，多用于控制高血压、高血脂、高血糖。维吾尔人用两色金鸡菊头状花序作为草药茶来治疗高血压和腹泻。现代药理研究表明，两色金鸡菊茶饮具有改善胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性作用[12]；两色金鸡菊乙酸乙酯部位能够改善链脲佐菌素诱导的2型糖尿病模型及其并发症[13-14]，如肾纤维化等。基于两色金鸡菊良好的药效，需进一步研究两色金鸡菊的药效物质，目前虽有对两色金鸡菊粗提物进行含量测定的相关研究[9-11]，但多是建立5～8个化合物的含量测定方法，缺乏系统全面的质量控制。为进一步富集两色金鸡菊总黄酮，采用大孔树脂对两色金鸡菊粗提物进行纯化，从而富集到两色金鸡菊总黄酮部位。通过建立UPLC-DAD液相方法，首次测定了两色金鸡菊总黄酮部位的10种主要成分，包括9种黄酮类成分和1种苯丙素类成分。其中，化合物2R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷是存在R、S两种构型，目前对该化合物进行含量测定的，均是测定两种化合物的总含量[10，15]，故本文测定了2R/S-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷的两种化合物构型的总含量。仪器精密度、方法重复性、样品稳定性、线性关系和加样回收率等均符合要求，表明所建立的基于UPLC-DAD多成分含量测定方法能够满足两色金鸡菊总黄酮主要成分的含量测定。

使用DAD紫外检测器对供试品溶液进行全波长扫描，比较供试品溶液在285、378、275 nm下的色谱图数据，结果表明在285、378 nm波长下，基线平稳、出峰数多，色谱峰响应值较高，其中化合物3、5、6、7、8、10在378 nm下分离度及色谱峰响应值较高，故最终选用285、378 nm作为检测波长。供试品提取采用80%甲醇超声提取40 min，发现供试品溶液呈棕褐色、透明状，表明此方法提取率较高。

目前有关两色金鸡菊单体成分的研究集中于黄酮类成分，如马里苷[16-17]、奥卡宁[18]。此外，有研究发现，益母草胰岛素增敏部位含有苯丙酸类化合物[19]，这表明，除了黄酮类成分，苯丙素类化合物也有可能是两色金鸡菊改善胰岛素抵抗的有效物质基础。故而，本实验对两色金鸡菊的9种黄酮类成分及1种苯丙素成分建立了质量控制方法，为进一步药效物质的研究提供了理论依据。