银杏叶提取物抑制肾间质纤维化作用研究

温 泉，荘健春，张 红，张永凯

(吉林大学第一医院，吉林 长春130021)

肾间质纤维化是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同途径和主要病理基础，是各种慢性肾病的共同转归。肾间质纤维化程度与肾功能受损程度高度相关，有效抑制和/或延缓肾间质纤维化进程，对肾脏功能的保护和延缓各种慢性肾病进展起重要作用，直接关系到慢性肾脏病患者的预后及转归。转化生长因子-β(TGF-β)是最重要的肾间质纤维化相关的生长因子，多种原因引起的肾纤维化均可见其高表达，且其表达量也与肾间质纤维化程度高度相关。结缔组织生长因子(CTGF)是TGF-β的下游因子，是由TGF-β激活后的早期即刻表达因子，与TGF-β相比，CTGF促组织器官纤维化效应特异性更高，抑制TGF-β/CTGF通路对多种器官纤维化的防治可能具有重要意义。由于中医药可通过多种机制发挥其保护肾功能、抑制或延缓肾间质纤维化进程等作用，在肾间质纤维化的治疗中显示了特有的优势。有研究显示，银杏叶提取物(GBE)可抑制体外培养的肾间质成纤维细胞糖基化终末产物诱导的TGF-β1和CTGF mRNA过表达[1]。唐锦辉等[2]用GBE预防性治疗大鼠实验性肾小球硬化，发现GBE可以明显减轻残肾系膜区ECM积聚，降低肾小球硬化指数，明显减少肾脏组织中轻脯氨酸含量，并明显减轻肾小管间质细胞的增殖。本研究拟以单侧输尿管结扎法(UUO)复制大鼠肾间质纤维化模型，同时用GBE进行干预，探讨GBE防治肾间质纤维化效果及其机制，为中药治疗肾间质纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

银杏叶片(批号:20151209)购自贵州信邦制药股份有限公司；盐酸贝那普利片(批号:15083)购自北京诺华制药有限公司；羟脯氨酸含量测定试剂盒(A030)购自南京建成生物工程研究所；免疫组化染色试剂盒(PV-6000)和DAB显色试剂盒(ZLI-9017)多克隆抗体为北京中杉金桥生物工程公司产品；兔抗大鼠TGF-β1(A2124)和CTGF(A11943)抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；TRIzol、二步法逆转录PCR试剂盒(AQ201)购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 造模及分组

Wistar大鼠，雄性，体重180-200 g，购自辽宁长生生物技术有限公司(许可证号：SCXK(Liao)2015-0001)，于吉林大学医学实验动物中心饲养。所有实验得到了动物管理机构的批准，且经吉林大学药学院实验动物伦理委员会同意。

大鼠适应性饲养7 d后，随机分为假手术组、模型组(UUO组)、银杏叶治疗组及贝那普利治疗组，每组6只大鼠。除假手术组外，其余各组大鼠经乙醚吸入麻醉后，无菌条件下行腹正中偏左纵切口进入腹腔，游离左侧输尿管，在靠近肾门处及输尿管下段分别结扎，并从中间剪断输尿管，逐层缝合腹壁及皮肤。假手术组只单纯分离但不结扎和剪断输尿管即关闭腹腔。

1.3 给药方法

自造模后第2天起各组动物开始给药。银杏叶治疗组以150 mg/kg体重银杏叶注射液腹腔注射，贝那普利治疗组以15 mg/kg体重盐酸贝那普利片混悬液灌胃，UUO组和Sham组给予等体积生理盐水灌胃，每日一次。给药2 w后，各组大鼠乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死，迅速取左侧肾脏，上1/3于-20℃、下极1/3于-80℃贮存，中段1/3固定于10%中性甲醛缓冲溶液。

1.4 羟脯氨酸含量测定

取100 mg大鼠肾脏组织，按照羟脯氨酸含量测定试剂盒说明书以碱水解法进行羟脯氨酸含量测定。大鼠肾组织羟脯氨酸含量以μg/mg组织湿重计。

1.5 免疫组化检测

用免疫组化法检测各组大鼠心肌组织糜酶表达量。主要操作步骤：石蜡包埋肾组织切片经二甲苯脱蜡、水化后，置于pH6.0枸椽酸缓冲液中以微波加热法进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶后，加适量一抗(抗TGF-β1和CTGF抗体稀释比例为1∶200和1∶300)4℃孵育过夜，次日以适量酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物室温孵育20 min后用适量新鲜配制的DAB显色液显色，苏木素复染后脱水、透明、返蓝，用ImageJ1.52分析染色阳性信号表达强度(IOD)。

1.6 实时定量RT-PCR检测

采用相对定量实时定量RT-qPCR法检测各组大鼠肾脏组织TGF-β1和CTGF mRNA表达。主要操作如下：按TRIzol说明书提取各组大鼠肾脏组织进行总RNA提取。按二步法逆转录PCR试剂盒说明书进行逆转录和PCR反应，以GAPDH作为内参。逆转录体系总体积为20 μl，含总RNA 1 μg，5XTransScript○RAll-in-one SuperMix for qPCR 4 μl，gDNA Remover 1 μl，经45℃孵育15 min，85℃孵育5 s以灭活逆转录酶和gDNA Remover。PCR体系总体积为20 μl，含mRNA模板 1 μl，上、下游引物各0.2 μl，2XTransStart○RTip Green qPCR SuperMix for qPCR 10 μl，94℃ 30 s预热后，经94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃共40个循环。TGF-β1引物序列上游：5′-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3′，下游：5′-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAA-3′；CTGF引物序列上游：5′-CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3′，下游：5′-CTCAAAGATGTCATTGCCCCC-3′；内参GAPDH引物序列上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′。以2-ΔΔCT表示糜酶mRNA的相对表达量，ΔΔCT=(CTchymase-CTGAPDH)experiment-(CTchymase-CTGAPDH)control[3]。

1.7 数据分析

2 结果

2.1 各组大鼠肾纤维化程度比较

实验结束后，各组大鼠状态良好，对照组大鼠双侧肾脏对称，体积及重量均无明显改变，其余各组大鼠左侧肾脏体积明显增大，肾盂内大量尿液潴留，肾皮质变薄。羟脯氨酸含量测定结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠肾组织羟脯氨酸含量均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，银杏叶治疗组及贝那普利治疗组大鼠肾组织羟脯氨酸含量比较，差异无显著性，但均明显低于模型组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肾组织羟脯氨酸含量表达比较

与假手术组比较，*P<0.05，与模型组比较，ΔP<0.05。

2.2 各组大鼠肾组织TGF-β1和CTGF表达比较

免疫组化结果发现，正常大鼠肾间质即有少量TGF-β1和CTGF表达，图像分析结果显示，模型组大鼠左侧肾间质TGF-β1和CTGF表达量均明显升高，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而二者在银杏叶治疗组及贝那普利治疗组大鼠肾间质表达量差异无显著性，但均明显低于模型组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2和表2。

A.假手术组；B.模型组；C.银杏叶治疗组；D.贝那普利治疗组

A.假手术组；B.模型组；C.银杏叶治疗组；D.贝那普利治疗组

表2 各组大鼠肾组织TGF-β1和CTGF免疫组化结果比较

与假手术组比较，*P<0.05，与模型组比较，ΔP<0.05。

2.3 各组大鼠肾组织TGF-β1和CTGF mRNA表达比较

与假手术组大鼠比较，模型组大鼠左侧肾组织TGF-β1和CTGF mRNA表达量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而二者在银杏叶治疗组及贝那普利治疗组大鼠肾组织表达量差异不显著，且均明显低于模型组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

3 讨论

银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科、银杏属落叶乔木，其叶和果有重要药用价值。大量研究显示，GBE具有扩血管、降血脂、抗凝血、清除自由基、及抗炎、镇痛和抗肿瘤等作用，已广泛应用于心、脑血管疾病的预防和治疗。赵艳玲等[4]发现，GBE可明显抑制马兜铃酸肾病大鼠血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平，并抑制肾组织中TGF-β1和CTGF的表达，表明GBE对马兜铃酸致肾纤维化有一定防治作用。刘晓刚等[4]研究显示，GBE可减少肾病综合征大鼠尿蛋白量，并降低其血脂水平。李相军等[6]研究发现，给UUO大鼠口服GBE 2周后，GBE组大鼠NAG酶活性、尿肌醉、血尿素氮及血肌醉较UUO组均显著降低，24 h尿蛋白排出量亦明显下降，说明GBE对肾脏功能具有保护作用。本研究发现，GBE可明显抑制UUO引起的大鼠肾间质羟脯氨酸含量，表明GBE可抑制或延缓肾间质纤维化进程。

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1和CTGF免疫组化结果比较

与假手术组比较，*P<0.05，与模型组比较，ΔP<0.05。

TGF-β是一种强效的致纤维化因子，在肾间质纤维化进程中多个环节中均起重要作用。CTGF作为TGF-β下游因子，具有更明显的促进肾脏间质细胞增殖和细胞外基质的合成与分泌作用。有研究表明，UUO大鼠术后第1天即有肾组织TGF-β1 mRNA表达升高，而CTGF mRNA及蛋白表达量于UUO术后第3天开始升高直至实验结束(14 d)，与肾间质纤维化程度呈正相关，表明CTGF高表达是肾间质细胞外基质产生的重要驱动因素之一[7]。因此，CTGF与TGF-β相互促进，形成正反馈，并通过TGF-β/CTGF/ECM通路参与肾间质纤维的形成和发展。本研究用免疫组化法及实时定量RT-PCR法均证实，应用GBE 2周后，TGF-β1及CTGF在肾间质中表达明显减少，其mRNA表达量亦明显低于UUO模型组大鼠，结果表明，GBE延缓肾间质纤维化的机制与其抑制TGF-β1/CTGF通路有关，这可能是GBE的治疗靶点之一。