高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中紫杉醇的浓度

谢文敏

【摘要】目的：通过高效液相色谱-串联质谱法构建对大鼠血浆中紫杉醇浓度的检测。方法：使用克拉霉素溶液作为内标物，大鼠血浆样品通过乙腈溶液处理后，进行HPLC-MS检测。结论：本实验利用高效液相色谱-串联质谱法（简称为HPLC-MS）对血浆中紫杉醇浓度进行检测，具有检测速度快、检测灵敏度高的特点，能够实现临床治疗过程中的检测要求。

【关键词】紫杉醇;高效液相色谱-串联质谱法

【中图分类号】R123【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2019）06-252-01

0 引言

紫杉醇，又叫泰素，其化学结构在1971年被确定，是一种四环二萜类化合物。它是一种良好的抗肿瘤药物，当肿瘤细胞发生分裂时，它可以和微观蛋白发生聚合作用，从而阻碍肿瘤细胞进行有丝分裂的过程，使得肿瘤细胞停止生长。通过相关的临床试验结果表明，紫杉醇在许多肿瘤类疾病，例如：卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、肺部肿瘤、淋巴肿瘤等，具有一定的治疗效果。因此，对血浆中紫杉醇浓度进行检测这一项目有着重要的现实意义[1]。

通过相关文献调研，我们药厂发现国内外科研工作者主要利用反相高效液相色谱法对血浆中紫杉醇浓度进行检测，但是反相高效液相色谱法存在对样品检测的灵敏度较低、操作流程不简洁以及检测时间较长等问题[2-3]。因此，我们药厂利用了一种检测速度快、检测灵敏度高的高效液相色谱-串联质谱法（简称为HPLC-MS）对血浆中紫杉醇浓度进行检测，现给出我们药厂的检测报告如下：

1 实验部分

1.1 药品

我们药厂以对照品紫杉醇，其含量为99.5%作为检测试样;以对照品克拉霉素，其含量为99.9%作为内标物。其他全部药品为分析纯。

1.2 仪器

我们药厂采用高效液相色谱-串联质谱法，具体型号为Agilent 1100 LC/MSD SL，同时，为这台仪器配置电喷雾离子化电离源（ESI）;还采用高温低速离心机，具体型号为Eppendorf 5427 R，来自于美国Eppendorf公司。

1.3 实验对象

我们药厂利用四只雄性的大鼠作为研究对象，大鼠均来自于动物繁殖场，大鼠质量约为（230 ± 20）克。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

高效液相色谱的色谱柱为2.1毫米 × 150毫米，5微米;高效液相色谱的流动相为甲醇和0.05%甲酸水溶液，其体积比为70 ： 30;高效液相色谱的流动速度为每分钟0.2毫升;高效液相色谱的柱温为25 ℃。

2.2 质谱条件

质谱法所采用的离子源为电喷雾离子化电离源（ESI），其中雾化气压为20 Pa，气体流动速度为每分钟10.0毫升，温度为350 ℃。通过正离子的方式检测，从理论上来说，紫杉醇的质谱数据为 m/z = 876.5 [M + Na]+，而克拉霉素的质谱数据为m/z = 748.6 [M + H]+。

2.3 大鼠血浆样品的处理

我们量取0.2毫升的大鼠血浆，向其中加入10微升的内标物克拉霉素溶液，将两者混合均匀;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振荡1.5分钟，然后静置;通过高速离心机离心10分钟，离心机的转速为每分钟2000转;随后取上层清澈液体20微升，加入到高效液相色谱-串联质谱仪器中进行检测。

2.4 质谱分析

质谱仪通过正离子的方式检测的情况下，紫杉醇通常会产生[M + Na]+的分子离子峰，质谱数据为 m/z = 876.5;内标物克拉霉素通常会产生[M + H]+ 的分子离子峰，质谱数据为 m/z = 748.6，因此在对样品做定量分析时，我们要选择性检测出上述分子离子峰。

2.5 方法学研究

2.5.1 配制标准溶液 对于紫杉醇标准溶液的配制，首先，使用精密度較高的分析天平称量0.0120克紫杉醇标准物质，将其溶解在甲醇溶液中，再使用10毫升的容量瓶对上述溶液进行定容。当进行相关的实验时，可以通过将上述溶液稀释成不同浓度来进行实验。

对于内标物克拉霉素标准溶液的配制，首先，使用精密度较高的分析天平称量0.0121克克拉霉素内标物的标准物质，将其溶解在甲醇溶液中，再使用10毫升的容量瓶对上述溶液进行定容。当进行相关的实验时，可以通过将上述溶液稀释成不同浓度来进行实验。

2.5.2 方法专属性

量取0.2毫升的大鼠血浆，向其中加入4毫升的乙腈溶液，振荡1.5分钟，然后静置;通过高速离心机离心10分钟，离心机的转速为每分钟2000转;随后取上层清澈液体20微升，加入到高效液相色谱-串联质谱仪器中进行检测。

量取0.18毫升的大鼠血浆，向其中加入10微升的内标物克拉霉素溶液和20微升的一定浓度的紫杉醇溶液，将两者混合均匀;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振荡1.5分钟，然后静置;通过高速离心机离心10分钟，离心机的转速为每分钟2000转;随后取上层清澈液体20微升，加入到高效液相色谱-串联质谱仪器中进行检测。

上述结果表明，紫杉醇的保留时间为2.0分钟，而克拉霉素的保留时间为2.5分钟，与此同时，在空白血浆的样品中，其内源性物质不影响实验的测试结果，包括紫杉醇的保留时间与克拉霉素的保留时间测定。这样的结果表明，该方法有比较高的专属性。

2.5.3 标准曲线制备

量取0.18毫升的大鼠血浆，向其中加入10微升的内标物克拉霉素溶液和20微升的一定浓度的紫杉醇溶液，其中选取的紫杉醇浓度分别为每毫升7.5纳克， 15.0纳克， 60.0纳克， 150.0纳克， 300.0纳克， 600.0纳克， 1200.0纳克， 6000.0纳克），向其中加入4毫升的乙腈溶液，振荡1.5分钟，然后静置;通过高速离心机离心10分钟，离心机的转速为每分钟2000转;随后取上层清澈液体20微升，加入到高效液相色谱-串联质谱仪器中进行检测，对色谱图进行记录，绘制出检测物浓度（以此为横坐标）与检测物和内标物的峰面积比值（以此为纵坐标）的曲线图，通过最小二乘法对上述数据使用回归计算，得到的线性回归方程为 Y = 1.7089 C + 0.0069，其中相关系数r = 0.9999，对应获得的紫杉醇的线性范围在7.5到6000.0 纳克/毫升之间，定量限在7.5纳克/毫升。

2.5.4 回收率及精密度检测

量取大鼠血浆，向其中加入一定量紫杉醇溶液，配制成多份浓度为15纳克/毫升、300纳克/毫升、6000纳克/毫升的紫杉醇血浆溶液，再向其中加入10微升的内标物克拉霉素溶液，将两者混合均匀;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振荡1.5分钟，然后静置;通过高速离心机离心10分钟，离心机的转速为每分钟2000转;随后取上层清澈液体20微升，加入到高效液相色谱-串联质谱仪器中进行检测，通过任意标准曲线计算回收率。每天平行做五次实验，隔一天再平行做5次实验，将其统计为日内精密度与日间精密度和回收率，见表1所示。

2.5.5 稳定性检测

对于溶液的稳定性来说，选取相同的溶液进行检测，检测时间分别为直接检测、一小时、四小时、八小时、十二小时与二十四小时，对溶液血浆浓度进行计算，RSD的数值为1.01%，表明在二十四小时以内该溶液处于稳定状态。

对于溶液的冷融稳定性来说，选取三个样品进行检测，其浓度分别为低浓度、中浓度和高浓度，把三个样品放置于零下20 ℃中，检测时间分别为直接检测、一天、三天、七天与十四天，对溶液血浆浓度进行计算，得到的低浓度、中浓度和高浓度的RSD的数值为7.17%、5.63%、2.10%，表明在冷藏十四天以内该溶液处于稳定状态。

3 结论

本实验利用高效液相色谱-串联质谱法（简称为HPLC-MS）對血浆中紫杉醇浓度进行检测，具有检测速度快、检测灵敏度高的特点，能够实现临床治疗过程中的检测要求[4]。

参考文献：

[1]李天雪，胡玉涛，陈如洋， 褚朝森.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中阿帕替尼与紫杉醇[J].分析测试学报， 2018， 4（37）： 477～481.

[2]陈华，吴筱丹，许东航，徐翔.高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆紫杉醇浓度[J].医药导报， 2007， 7（26）： 734～736.

[3]陈小欢，许杜娟，夏泉，等.反相高效液相色谱法测定人血浆中紫杉醇的浓度[J].安徽医药， 2012，16（1）：35-37.

[4]刘韬，黄红兵，林子超，等.高效液相色谱法测定人血浆中多西紫杉醇浓度[J].中国医院药学杂志，2007， 27（7）：897-899.