菌糠炭与微生物协同吸附-降解石油烃类污染物

2019-08-01张博凡徐文斐王加华张秀霞刘会娥顾莹莹

石油学报（石油加工） 2019年4期

张博凡，徐文斐，王加华，熊鑫，韩卓，张秀霞，张钊，刘会娥，顾莹莹

(1.中国石油大学(华东)化学工程学院，山东青岛 266580；2.上海康恒环境股份有限公司，上海 201700；3.胜利油田分公司技术检测中心，山东东营 257000)

随着石油工业的发展，石油污染逐渐加剧[1]，有机污染物质在环境中残留时间长，结构稳定、不易降解，对环境及人体造成严重威胁。由于微生物修复技术具有成本低、无二次污染及处理效果好等优点，近年来在有机污染修复中应用比较广泛[2]。固定化微生物技术因其具有菌密度高，有利于屏蔽恶劣环境等优势，受到越来越多的关注与应用[3]。

菌糠(Spent mushroom substrate，SMS)是食用菌种植业的残余废料，每生产1 kg食用菌约产生5 kg 菌糠[4]，每年大约有8000多万t废弃菌糠通过焚烧、填埋等传统方式处理，不仅浪费土地资源，还会造成不同程度的环境污染。研究发现，菌糠中含有丰富的营养物质、大量真菌菌丝体以及酶类物质，其不仅可以作为微生物载体，又可以通过真菌-酶强化细菌降解有机污染物[5-7]，提高污染物去除效率。

生物炭是由生物质热解所得的一种多孔且富含碳的固体产物，它具有较大的比表面积、丰富的表面官能团和发达的孔隙结构可以吸附重金属和有机污染物[8]，其结构和组成的优势在环境污染修复中具有巨大的潜在应用价值。生物炭的性质受制备温度、原材料、保留时间等多种因素影响，其中热解温度对其性质影响较为显著，不同温度下制备的生物炭对有机污染物的吸附性能也存在较大差异[9-10]。

目前对于吸附法固定化微生物技术修复有机污染物的研究取得了一定的成效[11]，寻找优良的吸附载体是该技术的关键步骤，由菌糠限氧热解制备所得的菌糠炭不仅能为微生物提供生存场所，提高吸附固定化效果[12]，解决微生物易脱落的问题，同时对石油烃有较强的吸附能力，增大微生物与石油烃接触，进而提高降解效果，成为近几年研究热点。

笔者通过制备不同温度下(250、350、450、550、650 ℃)的菌糠炭，分析菌糠及不同温度菌糠炭的结构差异，探究其对微生物、石油烃的吸附效果，并将其与筛选得到的高效降解菌结合，寻找最佳吸附固定化载体用于吸附-降解石油烃，分析不同吸附及降解效果与结构性质之间的关联性，进一步探究吸附-降解机制，同时为废弃生物质菌糠的资源化利用寻找新途径，以达到“以废制废”的双重效果。

1 实验部分

1.1 实验材料

石油选自胜利油田原油，其中四组分饱和分、芳香分、胶质、沥青质质量分数分别为49.15%、22.38%、23.12%、5.35%。

实验菌株Q1是以胜利油田污染土壤为菌源，以胜利原油为碳源，经16S rDNA生物分子学鉴定为Ochrobactrumsp.Q1，在原油质量浓度为 1000 mg/L 的无机盐培养基中，苍白杆菌Q1在7 d内对石油烃四组分降解率分别为30.87%、18.69%、4.57%、2.38%。

菌糠选自山东青岛天农食用菌有限公司，将菌糠放置于冰箱保存，取部分洗净后于75 ℃烘箱中干燥12 h，将其粉碎过筛密封保存。

1.2 菌糠炭的制备

将已烘干的菌糠(记为SMS)置于陶瓷坩埚中，压实盖子，包上铝箔锡纸密封，放于管式炉中热解炭化。设置升温速率为10 ℃/min，制备温度分别为250、350、450、550、650 ℃，保留时间为3 h，冷却至室温后，密封保存备用，样品分别记为BC250、BC350、BC450、BC550、BC650。

1.3 菌糠及菌糠炭养分测定及表征

参照GB/T 12496.7—1999 《木质活性炭试验方法-pH值的测定》测定pH值。采用重铬酸钾氧化外加热法测定有机质[13]；采用凯氏定氮法测定全氮[13]；采用NaHCO3-钼锑抗比色法测定有效磷[13]；采用Boehm滴定法测定表面官能团含量[14]；采用酸碱滴定法测定表面零电荷点[15]。

采用元素分析仪测定C、H、N元素含量；采用傅里叶变换红外光谱仪分析表面官能团；采用扫描电子显微镜(SEM)观测形状及表面形态；采用ASAP2020M型物理分析仪测定比表面积、孔体积和孔径大小。

1.4 菌糠及菌糠炭吸附-降解性能实验

1.4.1 菌糠及菌糠炭对微生物的吸附实验

苍白杆菌Q1活化16 h后，此时菌液浓度为2.139×109CFU/mL，将其与菌糠和菌糠炭分别以20/1和10/1体积比混合，置于30 ℃、160 r/min的摇床中振荡吸附，于 0.5、1、2、3、5、10、18、24和30 h进行取样测定，将样品在1000 r/min条件下离心分离10 min，弃去上清液，将离心所得沉淀真空冷冻干燥，即得到固定化微生物。采用稀释平板计数法测定固定化微生物中吸附固定的生物量。

以吸附时间为横坐标，吸附微生物量为纵坐标，绘制出吸附曲线，并确定最佳吸附微生物载体。

将制备所得的固定化菌剂样品用Biosafer-10A型真空冷冻干燥机干燥，喷金后进行电镜扫描。

1.4.2 菌糠及菌糠炭对石油烃四组分的吸附实验

将灭菌后的菌糠及菌糠炭分别以1/100和 1/200(m/V，g/mL)比例投入质量浓度为1000 mg/L的原油培养基中，同时加入NaN3抑制微生物降解作用，置于30 ℃、160 r/min的摇床中振荡，吸附24 h后在5000 r/min下离心分离10 min，将上清液转移至锥形瓶中，并加入50 mL二氯甲烷进行震荡，并在超声波中萃取15 min，超声波强度 100 W，超声水浴温度25 ℃，超声结束后转移至分液漏斗中，振摇，弃去水相，有机相用无水硫酸钠过滤脱水，接收滤液于蒸发瓶中，置于干燥箱50 ℃下蒸干水分，提取的油样经真空冷冻干燥后，采用NB/SH/T0509—2010《石油沥青四组分测定法》对四组分分离，测定其各自吸附量。

1.4.3 菌糠及菌糠炭协同微生物对石油烃的吸附-降解实验

将1.4.1节中吸附饱和后所得的固定化菌剂投入质量浓度为1000 mg/L的原油培养基中，置于30 ℃、160 r/min的摇床中振荡培养，7 d后取样，按1.4.2节中所述方法测定剩余石油烃四组分含量，进而计算出各组分降解率。

1.4.4 相关性分析

采用SPSS 22.0软件分析菌糠炭对微生物、石油烃吸附效果及协同微生物对石油烃吸附-降解效果，与载体材料理化性质及结构特性间的相关性。

2 结果与讨论

2.1 菌糠及菌糠炭的性质分析

不同温度下热解制备的菌糠炭(250～650 ℃)的基本性质如表1所示。由表1可以看出，随着制备温度升高，pH值增加，由6.50升至13.21，原材料呈弱酸性，而菌糠炭碱性不断增强；养分中的有机碳质量分数由15.45 mg/g增至34.48 mg/g，全氮质量分数由21.12 mg/g降低为14.44 mg/g，有效磷含量呈先升高后降低趋势；菌糠及菌糠炭的养分，可以为微生物提供充足的营养物质，保证其生长繁殖，提高菌密度；炭化温度越高，碱性官能团含量增加，部分含氧酸性官能团受热发生分解，导致其含量减少。表面零电荷点pHPZC作为表征酸碱性的参数之一，是指水溶液中固体表面净电荷为零时的pH值。生物炭pHPZC与表面酸性官能团羧基含量存在密切相关性，酸性官能团在水中分解产生氢离子，pHPZC数值减少，且热解温度越高，含氧官能团含量较低，pHPZC由7.09增加到9.83，碱性增强，这与上述菌糠和菌糠炭pH值数据相吻合。菌糠炭中C元素质量分数从33.46%增加至38.94%，H、N元素含量减少，n(H)/n(C)可以用来表征其芳香性，随着温度的升高，n(H)/n(C)由1.59降低到0.20，这表明热解过程中水分和脂肪族化合物流失，芳香性增强，碳化更为彻底，稳定性提高。同时，菌糠炭比表面积和孔体积呈现一定变化规律，在温度区间250～550 ℃时，比表面积由 4.0804 m2/g 增加至109.2691 m2/g、孔体积由0.010968 cm3/g增加至0.102631 cm3/g；而BC650比BC550的比表面积和孔体积均有所减少，说明温度升高，孔道被打开呈无序状态，从而使比表面积增加，孔结构更为发达，但制备温度较高时易造成孔结构塌陷，孔道堵塞，比表面积减少，孔体积也相应减少。

表1 菌糠和菌糠炭的基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of SMS and biochars

图1为菌糠及菌糠炭的FTIR谱图。由图1可以看出，菌糠及不同温度下的菌糠炭都含有丰富的官能团结构，随着热解温度升高，官能团总含量减少，菌糠以及菌糠生物炭均在3447 cm-1处有吸收峰，此处是—OH伸缩振动，且随着温度升高，有机物分解脱去结合水，羟基峰逐渐减弱；2924 cm-1处，C—H伸缩振动峰逐渐消失，SMS和BC250较为明显，而BC450、BC550、BC650几乎缺失，这表明碳化过程中，烷基链不断缺失，菌糠炭芳香性增高。在1000～1300 cm-1附近为芳环C—H的伸缩振动，在1635 cm-1附近出现芳烃骨架伸缩振动峰，且温度越高，基团含量骤减，这可能是由于热解过程中木质纤维素等大量分解，芳烃骨架发生断裂所致；1435 cm-1为芳环 C—C 的伸缩振动，775和 876 cm-1附近吸收峰为芳环C—H的弯曲振动，其振动强度随温度升高变化较为明显，表明温度越高，菌糠炭的芳香性及稳定性越强，吸附有机物能力较好，这与上述元素分析结果相一致。

图1 菌糠及菌糠炭的FT-IR谱图Fig.1 FT-IR spectra of SMS and biochars

2.2 菌糠及菌糠炭对微生物的吸附性能

菌糠及菌糠炭对苍白杆菌Q1的吸附曲线如图2所示。由图2可以看出，在初始阶段，吸附较为迅速，吸附量上升明显，这是由于初期载体材料吸附位点暴露明显，微生物活性高，因此吸附速率快。在10 h附近，吸附变得较为缓慢，吸附位点大多数已被占据，传质作用受到限制，吸附量不再增加，吸附基本接近平衡。其中菌糠炭BC550吸附平衡时间较短，吸附固定化微生物量较大，为1.582×1010CFU/g，即1 g固定化微生物的生物量相当于7.42 mL游离菌菌液的生物量。一方面是由于较高温度下制备的菌糠炭吸附位点较多，与微生物结合作用力大于静电斥力，载体材料表面碱性官能团含量增加，与细胞间疏水作用减弱，结合更为牢固；另一方面，BC550孔结构发达，比表面积大，表面粗糙更有利于微生物分泌的聚合物形成生物膜附着，使得载体和微生物之间形成共价键，从而形成特异性吸附，吸附迅速且效果稳定持久。而BC650因制备温度过高，使得孔结构塌陷，比表面积减少，吸附量小于BC550。这也进一步说明微生物固定化效果受载体材料表面结构特性影响较大。随着时间的延长，吸附量略微降低，吸附基本接近饱和，此时微生物活性下降，吸附位点被全部占据[16]，吸附不再进行。

图2 菌槺及菌槺碳对菌株Q1的吸附固定曲线Fig.2 Adsorption curve of bacteria Q1 onto SMS and biochars

图3为BC550对菌株Q1微观结构固定化前后扫描电镜照片。由图3可以看出，附着在BC550表面的为杆状菌，这与实验前期对Q1分子生物学鉴定为杆状菌结果相一致，因杆菌一般长为5～15 μm，宽为0.3～0.5 μm[17]，经测定BC550平均孔径为8.8 nm，菌株难以进入到生物炭孔道内部，因此苍白杆菌Q1吸附在菌糠炭表面。

图3 生物炭样品BC550及其固定化菌株Q1的SEM照片Fig.3 SEM photos of BC550 and its immobilized bacteria Q1(a)BC550;(b)BC550 immobilized bacteria Q1

2.3 菌糠及菌糠炭对石油烃四组分的吸附性能

菌糠及不同温度下制备的菌糠炭对石油烃四组分的吸附效率如图4所示。

图4 菌糠及菌糠炭对石油烃四组分的吸附率Fig.4 Adsorption efficiency for different components of oil by SMS and biochars

由图4可以看出，不同温度下制备的菌糠炭对石油烃四组分吸附率呈现不同的变化趋势。对于饱和分和芳香分，随着温度升高，吸附率先增加后减少，其中BC450吸附效率最高，分别为42.22%、30.98%。对于胶质、沥青质，高温菌糠炭吸附性能比低温炭优异，但由于温度过高，孔口堵塞，孔道发生扭曲，吸附位点减少，使得BC550对二者吸附率高于BC650，分别为36.33%、25.59%。总的来看，对总石油烃吸附率最高的为BC550。造成上述吸附性能差异的原因有多方面因素，是由多种吸附机制共同作用的结果：首先饱和分主要是一些烷烃类，为链状结构，胶质、沥青质主要是一些呈平面结构的环状芳烃类；而制备所得菌糠炭具有层状分布特性[18]，增强了后者填充菌糠炭孔隙的可能，一定范围内，温度升高，微孔体积和数量增加，污染物吸附进入空隙中会被阻拦无法出入，形成不可逆孔，吸附强劲有力，解吸作用较为困难。其次制备温度升高，芳香性增强，π电子增多，而芳烃π电子供体比烷烃多，这就使得炭与环状芳烃间形成 π-π 强电子交互作用，吸附作用稳定且不可逆。

2.4 菌糠及菌糠炭固定化微生物对石油烃四组分的吸附-降解性能

菌糠及不同温度下制备的菌糠炭固定化微生物对石油烃四组分的降解率如图5所示。

由图5可以看出，不同载体材料固定化微生物对石油烃四组分降解效果存在一定差异，对于饱和分和芳香分，其结构相对简单，容易被微生物降解，因此在四组分中降解率较高，其中BC550对二者降解效果最好，分别为62.04%、40.31%。对于胶质、沥青质，大多数为环状难降解芳烃类，SMS对其降解率最高，分别为17.26%、12.91%。尽管菌糠比表面积、孔体积较小，但由于菌糠呈现一定区域骨架结构[19]，有利于增加传质效果；其次菌糠中存在大量真菌菌丝体，能够分泌漆酶和锰过氧化物酶等，这些酶类能够黏附在载体表面及孔隙中协同降解菌构成真菌-酶-细菌体系，强化降解芳烃类物质。高温炭固定化微生物对石油烃的降解作用要强于低温炭，一方面是由于高温炭对污染物吸附性能好，能够增加微生物与污染物之间的接触机会，提高其生物可利用性，进而提高降解率，但由于BC650固定化微生物量低，吸附污染物能力较差，所以降解效率低于BC550；另一方面，菌糠低温下热解尚未完全，孔结构不发达，比表面积较小，固定化微生物的能力相对较差，因此降解效率较低。

图5 菌糠及菌糠炭固定化微生物对石油烃四组分的降解率Fig.5 Degradation rate of oil by SMS and biochars immobilized bacteria

石油烃降解效果不仅受载体材料结构性质影响，还与其理化性质、养分含量等因素有关，随着温度升高，所制备的载体材料pH值、有机碳含量不断增加，微生物在pH值为7～7.5左右[20]，充足营养物质时降解效果最佳，尽管BC550的pH值较高，但随着降解反应不断进行，其能够中和微生物降解石油烃所产生的有机酸等中间产物，使环境pH值接近中性；此外微生物活动受养分含量影响较大，而高温菌糠炭有机质含量较高，N、P含量适宜，能够为微生物的代谢活动提供充足养分，从而降解效果较佳。

此外，以二氯甲烷为溶剂对吸附降解后的固定化材料BC550离心、超声萃取进行解吸，并分析测定此时石油烃含量，数据结果表明，脱附后石油烃含量仅为总吸附量的10.47%，即大部分石油烃通过微生物降解作用去除；吸附降解实验表明，固定化载体材料BC550兼具吸附和降解能力，其中降解作用在去除污染物方面占据主导地位，较好的吸附能力在降解污染物过程中起到了促进作用，进而大大提高降解效率。

2.5 菌糠炭协同微生物对石油烃吸附及降解效果与其理化性质及结构特性之间的相关性

由上述结果分析可得，菌糠及菌糠炭协同微生物对石油烃降解效果与载体材料性质存在一定的相关性，采用SPSS 22.0软件对菌糠及菌糠炭协同微生物吸附-降解石油烃与材料的pH值、有机碳、全氮、速效磷、比表面积、孔体积、n(H)/n(C)、酸性官能团含量、表面零电荷点参数间相关性进行分析，实验结果如表2所示。

表2 菌糠及菌糠炭吸附-降解性能与其基本性质的相关性分析Table 2 Correlation of adsorption and degradation performance of SMS and biochars with its properties

1)Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed);2)Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).Thepvalue is the probability,which reflects the likelihood of an event happening.

由表2可以看出，菌糠及菌糠炭对微生物吸附与pH值、有机碳、BET比表面积、孔体积、表面酸性官能团摩尔浓度和表面零电荷相关性较为显著，分别为0.862、0.929、0.865、0.933、-0.892、0.929，这说明其对微生物的吸附不仅与载体材料结构和性质关系密切，还受一定的环境因素和营养物质的影响[21-22]。而对石油烃的吸附与比表面积、孔体积、n(H)/n(C)、酸性官能团摩尔浓度相关性显著，分别为0.878、0.968、-0.903、-0.843。与微生物吸附作用不同的是，石油烃吸附主要与吸附材料孔特性、n(H)/n(C)、表面官能团摩尔浓度密切相关，而受环境条件的限制相对较弱，其中pH值对其影响相对较弱，相关性系数为0.503，说明材料本身性质在吸附石油烃中占据主导位置。而菌糠及菌糠炭协同微生物对石油烃吸附-降解与多种因素相关性显著，该过程不仅涉及石油烃吸附作用，还包括微生物降解作用，其中显著性最强的为有机碳、孔体积和n(H)/n(C)，分别为0.902、0.927、-0.911，吸附-降解过程不仅要维持足够营养物质供微生物代谢繁殖，还要提供一定的生存场所。其次孔体积较大，孔结构发达，对石油烃吸附作用主要为孔隙填充，且菌糠炭温度较高时，芳香性增强，π-π键结合力牢固。因此进一步说明一定温度范围内，菌糠炭制备温度越高，对微生物、石油烃吸附越好，协同微生物对石油降解率也越高。

综合上述相关性分析，菌糠炭制备温度较高时，pH值、有机碳增加，微生物生长代谢所需营养物质充裕，其次芳香性、孔体积增大，稳定性增强，能为微生物提供生存场所；同时对石油烃吸附能力增强，微生物摄取石油烃能力增加，加速对石油烃的降解，其中BC550协同微生物对石油烃吸附-降解效果最好。