蛴螬提取物对实验性兔视网膜静脉阻塞不同时间窗TIMP-2表达的影响※

● 马骏旭 蒋鹏飞 彭 俊 彭清华，3▲

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是临床常见的视网膜血管病，目前尚无特效疗法，新生血管(RNV)是RVO的主要并发症。蛴螬首次记载于《神农本草经》，可治疗目疾，有破血、行瘀、散结、明目之功。蛴螬提取物可促进RVO出血的吸收、抑制RNV[1-2]，本文通过建立视网膜静脉阻塞的动物模型，进一步探讨了蛴螬对RNV的可能作用机制。

1 实验材料

1.1实验动物选用40只健康有色家兔，不限雌雄，体重1.8～2.3kg(合格证号：湘医动字第30-015号)。

1.2主要实验药品和试剂蛴螬提取物[制备方法参考阳长明的方法[3]，具体为：蛴螬400g(湖南东润联合医药有限公司中药材部)，清洗10遍以上，浸泡一晚，后洗至无臭味。加蒸馏水5kg，加37%HCl至PH值为2。高压蒸汽锅蒸2小时。纱布(4～5层)过滤，溶液中加40%NaOH至PH值为6.5～6.8。冷却后隔水加热，浓缩至1600mL(1mL溶液=0.25g生药)。装瓶，压盖，蒸汽高温灭菌，冷藏保存。]；复方血栓通片(扬州中惠制药有限公司，批号：B14002362976)；25%乌拉坦(上海伊卡生物技术有限公司，批号：MFCD00007966)；20%荧光素钠(上海伊卡生物技术有限公司，批号：71018944)；一抗为兔抗TIMP-2多克隆抗体(武汉默沙克生物科技有限公司，批号：kt50111)；二抗为生物素标记的IgG(武汉默沙克生物科技有限公司，批号：kt600010)。

1.3主要实验仪器显微图象分析系统(Mias-2000型)、凝胶成像系统[美国，Bio-Rad(Gel Doc XR +)]、电子秤(上海天平仪器厂， JY0001)、微量移液器[德国，eppendorf(1ml/200ul/10ul)]、PCR仪(德国，Biometra)、水平电转槽(北京六一仪器厂，DYCP-40C)、垂直板电泳槽(北京六一仪器厂，DYCZ-24D)、台式高速冷冻离心机(Thermo)、超纯水仪(millipore公司)、恒温摇床(金坛，THZ-82A)、紫外可见分光光度计(上海spectrum公司，SP-752)、水平摇床(北京六一仪器厂，WD-9405B)。

2 实验方法

2.1动物分组将40只有色家兔按随机数字表法分为空白组(A组)、模型组(B组)、复方血栓通组(C组)、蛴螬提取物组(D组)，每组10只动物(20只眼)。

2.2造模方法应用光化学动力法[4]制作实验性RVO模型，B、C、D组双眼散瞳后，麻醉动物，用激光对兔双侧视网膜静脉进行照射，同时避开伴行的动脉，看到有明显的远端静脉扩张时停止。

2.3动物给药方法A、B组予生理盐水5mL·Kg-1灌胃；C组予复方血栓通0.1g·kg-1溶于生理盐水中制成混悬剂，5mL·Kg-1灌胃；D组予蛴螬提取物1.5mL·kg-1灌胃。各组均为每日1次，持续至造模后3wk，于造模后1wk、3wk每组各随机处死5只动物。

2.4取材方法兔子处死后，摘除眼球，视网膜组织经酒精脱水、石蜡包埋后，做4μm厚的切片，烘干备用。

2.5检测方法

2.5.1 荧光素眼底血管造影(FFA) 造模后1wk、3wk对兔行FFA检查，使用Mias-2000型显微图象分析系统测量无灌注区(non perfusion area，NPA)和视盘(optic disk，OD)的面积并求出比值(S=N/D)[5]。分为有无灌注区、无新生血管(甲类)和有无灌注区、有新生血管(乙类)。

2.5.2 光镜观察方法 将取材的切片染色，做免疫组化组织学检测TIMP-2表达，在光学显微镜下主要观察视网膜组织变化。

3 结果

3.1FFA检查结果造模后1wk，B组中央静脉荧光渗漏、出血，C、D两组渗漏、出血较B组少，差异均有统计学意义(P<0.05)。造模后3wk，B组渗漏、出血的静脉周围已经出现无灌注区与新生血管；C组渗漏、出血与1wk时相比明显减小，与B组相比有统计学差异(P<0.05)；D组渗漏、出血基本吸收，与B组相比有统计学差异(P<0.05)，与C组相比无统计学差异(P>0.05)。S=N/D结果见表1。

表1 各组不同时间窗S=N/D的平均值结果

注：与B组比较，＊P<0.05；与1wk时相比，#P<0.05

3.2HE染色结果A组：视网膜各层结构清晰，细胞排列正常。B组：造模后1wk，视网膜组织水肿，细胞排列较乱，尚无新生血管索；造模后3wk，出现大量的新生血管索。C组：造模后1wk，视网膜组织水肿，细胞排列紊乱；造模后3wk，视网膜组织水肿较造模后1wk减轻，无新生血管索。D组：造模后1wk，视网膜组织水肿，细胞排列大致清晰；造模后3wk，视网膜组织水肿减轻，无新生血管索。见图1。

图1 各组视网膜组织HE染色(×400)

注：①-⑦分别表示A组正常视网膜、B组造模后1wk、B组造模后3wk、C组造模后1wk、C组造模后3wk、D组造模后1wk、D组造模后3wk的视网膜HE染色结果。

3.3TIMP-2染色结果造模后第1wk：各造模组TIMP-2表达均高于A组，有统计学差异(P<0.05)，B组TIMP-2表达与C、D组相比，有统计学差异(P<0.05)，而C、D组相比，无统计学差异(P>0.05)。造模后3wk：各造模组视网膜组织中TIMP-2表达均有不同程度减弱，D组的TIMP-2表达与1wk时相比有统计学差异(P<0.05)；而B组、C组的TIMP-2表达与1wk时相比无统计学差异(P>0.05)；C、D组TIMP-2表达均较B组强，有统计学差异(P<0.05)，C、D组相比，无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组TIMP-2阳性表达的平均光密度值

注：与A组比较，◇P<0.05；与B组比较，▲P<0.05；与1wk时比较，★P<0.05

4 讨论

视网膜静脉阻塞(RVO)是仅次于糖尿病视网膜病变的第二大致盲性视网膜血管病[6-8]，发病率较高，但目前尚不明了其发生机制[9-12]。

蛴螬是金龟子的幼虫，《神农本草经》曰：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤，青翳白膜。”《本草纲目》言其性微温，味咸，有破血、行瘀、散结、通乳、解毒、消疮、明目的功能。现代药理研究发现蛴螬对视网膜静脉阻塞所致的视网膜缺血缺氧状态有改善作用[1-2]，能够治疗视网膜静脉阻塞所致的视网膜病理损伤。

金属蛋白酶(MMPs)家族包括多个结构相似、能够消化基质和基膜的酶[13-17]，在视网膜静脉阻塞后并发视网膜新生血管的过程中，此家族蛋白可诱导新生血管的靶基因MicroRNA-188-5p[18]在新生血管的基底膜大量表达，迁移至内皮形成新生血管。而金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)家族是一组能抑制MMPs活性的多功能因子，通过对MMPs的抑制，在正常视网膜组织改建和各种病理过程中发挥重要作用。TIMP-2是21kD的非糖基化蛋白，含有192个氨基酸残基，对MMPs家族介导的新生血管形成有特别的抑制作用。李贞等[19]研究表明：TIMPs可抑制视网膜病的血管新生，机制可能是抑制了TIMP-2对VEGF的抑制作用。希望通过对TIMPs的研究，可以为视网膜新生血管及纤维增殖的治疗寻找一条新的途径。

本实验通过对FFA检查结果的分析发现，蛴螬提取物组实验兔RNV生成情况明显低于模型组。HE染色光镜观察结果显示，蛴螬提取物组视网膜组织损伤程度减轻，出血、渗出、水肿等病理改变均较模型组明显减轻，而与复方血栓通组相比无明显差别，说明蛴螬提取物能促进实验性RVO模型出血的吸收，改善视网膜缺血缺氧的状态，可以增强实验性RVO模型中TIMP-2的表达，从而可以抑制实验性RNV的形成，与复方血栓通有相当的作用。