甘草查尔酮A对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制▲

王梨明 范志浩 范晓丽 王 娟 王锐英 辛林伟 唐际存

(1 桂林医学院附属医院骨二科，广西桂林市 541001，电子邮箱:fxl911@126.com；2 广西壮族自治区南溪山医院辅助生殖科，桂林市 541002；3 桂林医学院科学实验中心，广西桂林市 541004)

骨肉瘤是导致儿童癌症死亡的最常见肿瘤，组织学表现为恶性间叶细胞的骨样生成，局部具有侵袭性并易发生转移[1-2]。目前，骨肉瘤主要以手术治疗为主，辅以化疗。由于化疗药物常对正常组织具有高毒性，容易导致贫血、中性粒细胞减少症、血小板减少症、心脏损伤和其他一系列不良反应，从而降低患者的生存率[3-4]。因此，寻找高效低毒的抗癌活性成分，对于改善骨肉瘤的临床疗效和预后具有重要的意义。甘草查尔酮A(licochalcone A，LCA)从常用中药-甘草中提取而来，是一种具有多重药理活性的黄酮类化合物，其抗肿瘤活性最受关注[5]。近年来，有研究显示LCA对多种肿瘤细胞如胃癌[6]、肺癌等[7]，都有明显的抑制作用，但对骨肉瘤细胞的作用尚不清楚。本研究旨在探讨LCA对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制，以期为LCA抗肿瘤的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 人骨肉瘤细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。

1.2 药物与试剂 LCA(纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：P21O8F46473)。杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；美国Gibco公司，批号：8117182)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美国Sigma公司，批号：D8418)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批号：20171012)，胰蛋白酶(Solarbio公司,批号：20170611)，噻唑蓝(南宁市博美生物科技有限公司，批号：K190622)，膜连蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate,Annexin Ⅴ-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司,批号：556547)，B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)单克隆抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)单克隆抗体(Abcam公司,批号：ab182858、ab32503)，β-肌动蛋白单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：15041)，兔二抗(依玛博科技有限公司，批号：171201)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与分组：用含10%胎牛血清及1%双抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)的DMEM培养液，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中常规培养人骨肉瘤细胞。用DMSO将LCA配制成80 mmol/L的原液，使用前用培养基稀释。实验分为空白组(LCA浓度为0 μmol/L)以及4个实验组(LCA终浓度分别为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)。

1.3.2 噻唑蓝法测定细胞增殖：将人骨肉瘤细胞接种于96孔板中，细胞浓度为1×105个细胞/mL，每孔200 μL细胞悬液，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养过夜。然后每组加入终浓度分别为0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的LCA，每组设5个复孔，继续培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μL噻唑蓝溶液，继续孵育4 h后弃孔内液体。每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，读取酶标仪(瑞士Tecan公司,Infinite M200 Pro型)490 nm波长处A值，实验重复3次。细胞增殖抑制率=(1-A药物组/A空白组)×100%。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡：将人骨肉瘤细胞接种于6孔板中，每组分别加入终浓度分别为0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的LCA处理48 h后，收集细胞，加入稀释好的结合缓冲液重悬细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶各5 μL，室温避光孵育20 min，过滤后用流式细胞仪(美国BD公司,C6plus型)检测。

1.3.4 蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达情况：取对数期人骨肉瘤细胞，按照实验分组加入LCA，药物作用48 h后收集人骨肉瘤细胞，RIPA裂解液充分裂解，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行电泳分离，利用湿转法将蛋白转移至膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入相应的一抗(1 ∶1 000)(Bcl-2、Bax和β-肌动蛋白)，4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜，之后二抗(1 ∶2 000)孵育1 h,以β-肌动蛋白作为内参，用Gel-Pro软件对蛋白条带进行分析。

1.4 统计学分析 实验数据采用SPSS 23.0软件进行分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，重复测量资料采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 5组人骨肉瘤细胞增殖抑制率的比较 5组细胞增殖抑制率差异有统计学意义(F组间=361.539，P组间<0.001)，各LCA组的抑制率均高于空白组，且随着药物作用浓度的增加，抑制率逐渐增高(均P<0.05)；抑制率有随时间增加的趋势(F组间=622.467，P组间<0.001)；时间与分组之间有交互作用(F交互=43.372，P交互<0.001)。见表1。

表1 5组人骨肉瘤细胞增殖抑制率的比较(x±s，%)

2.2 5组人骨肉瘤细胞凋亡率比较 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LCA组的细胞凋亡率均高于空白组(均P<0.05)。LCA浓度为10～40 μmol/L时，细胞凋亡率随着药物浓度增加而升高(均P<0.05)。见表2。

表2 5组人骨肉瘤细胞凋亡率比较(x±s,%)

注：与空白组比较，*P<0.05；与10 μmol/L LCA组比较，#P<0.05；与20 μmol/L LCA组比较，▲P<0.05。

2.3 5组人骨肉瘤细胞Bcl-2和Bax蛋白表达水平的比较 与空白组相比，20 μmol/L、40 μmol/L LCA组Bcl-2蛋白表达降低，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LCA组Bax蛋白表达升高。见图1及表3。

图1 5组人骨肉瘤细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达水平比较

注：a、b、c、d、e分别为空白组、5 μmol/L LCA组、10 μmol/L LCA组、20 μmol/L LCA组、40 μmol/L LCA组。

表3 5组HOS细胞Bcl-2和Bax蛋白表达比较

注：与空白组比较，*P<0.05。

3 讨 论

骨肉瘤是高发于儿童和青少年的骨组织恶性肿瘤，患者预后差，死亡率高。LCA来源于中国传统中药甘草，具有抗炎[8]、抗氧化[9]等多种药理学活性，近年来，有不少学者对LCA的抗肿瘤作用进行研究，但是其对骨肉瘤作用的研究较少，而且具体的作用机制尚不明确。本研究旨在探讨LCA对人骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响，并探究其可能的分子机制。

本研究结果显示，各LCA组人骨肉瘤细胞增殖抑制率均高于空白组，且随着药物作用浓度的增加，抑制率逐渐增加，LCA组的抑制率均有随时间增加的趋势(均P<0.05)，提示经LCA处理后人骨肉瘤细胞的增殖受到明显抑制，且呈浓度及时间依赖性。流式细胞术结果显示，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LCA组的细胞凋亡率均高于空白组(均P<0.05)，提示LCA可以有效促进细胞的凋亡，且LCA浓度为10～40 μmol/L时，细胞凋亡率亦呈浓度依赖性。

细胞凋亡通路主要有4条，即内质网通路、线粒体通路、死亡受体表达通路以及B粒酶通路[10]，其中细胞凋亡抑制基因Bcl-2蛋白家族作用位点主要在线粒体外膜上[11]。Bcl-2是研究最早的抗凋亡因子，其主要功能是抑制细胞凋亡、促进细胞存活，而Bax基因可加速细胞凋亡。研究表明，Bcl-2家族成员的构成比是调控细胞凋亡的关键，尤其Bcl-2/Bax是启动细胞凋亡的“分子开关”[12]。本研究结果显示，与空白对照组相比，LCA处理组Bax蛋白的表达水平升高，而Bcl-2蛋白的表达水平降低(P<0.05)。提示LCA可能通过调控Bcl-2和Bax蛋白的表达，促进骨肉瘤细胞的凋亡。

综上所述，LCA可以抑制细胞增殖，呈浓度及时间依赖性，并诱导细胞凋亡，在一定的干预浓度范围内亦呈浓度依赖性，其机制可能与上调Bax蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关，这为骨肉瘤的临床治疗提供了必要的理论依据。此外，值得注意的是，骨肉瘤的发生发展是多因素、多途径的过程，分子机制复杂，因此应用LCA治疗骨肉瘤仍需进一步的研究。