荔枝核总黄酮对大鼠结直肠癌前病变的影响▲

卢 青 成秋宸 肖绪华 范丽雯

(1 桂林医学院附属医院医院感染管理科，广西桂林市 541000，电子邮箱：18577956626@163.com；2 广西医科大学第一附属医院感染科，南宁市 530021)

异性隐窝灶(aberrant crypt foci,ACF)和腺瘤是结直肠癌两个重要的早癌阶段[1]。ACF是目前结直肠癌发生过程中能在光镜下观察到的最小且最早期的结直肠黏膜病变，被认为是肿瘤癌变前期病变。结直肠癌的发病机制至今尚未阐明，亦缺乏针对性的药物治疗。多项研究结果提示ACF可用来评价化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相应机制[2-3]。本课题组前期采用荔枝核总黄酮(total flavone ofsemenlitchi,TFL)体外干预人结直肠癌细胞株HT29，发现TFL具有抑制HT29细胞系增殖的作用，对相关分子通路的蛋白也有抑制作用[4]。本研究建立经典ACF癌前病变大鼠模型，再给予TFL灌胃，探讨TFL对大鼠结直肠癌前病变的抑制作用，以及对ACF中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)、核因子-кB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)p65基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只成年雄性Wistar大鼠，体重150～180 g，无特定病原体级，由广西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK桂2009-0002。适应性喂养1周，喂养环境温度(25±1)℃，湿度60%～80%，自由进食饮水，光照12 h/d。

1.2 药品与试剂 二甲肼购自Sigma公司(批号：#BCBQ2802V)，使用前用生理盐水配成2%的浓度，用NaHCO3调整pH值至6.5左右。TFL购自南京草本源生物科技有限公司(批号：ZC16081016)，纯度83.5%。谷胱甘肽测试盒购于南京建成生物工程研究所(批号：A061)。总RNA提取试剂盒购自中国康为公司(批号：CW0581)；反转录试剂盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 购自南京诺唯赞公司(批号：R223-01)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂购自南京诺唯赞公司(批号：Q311-02)。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 仪器 SZX10型解剖镜购自日本奥林巴斯公司，qTOWERE 2.2荧光定量PCR仪购自德国AnalytikJena公司，F200 PRO酶标仪购自瑞士Tecan Infinite公司，D3024R型冷冻离心机购自美国SCILOGEX公司，Tone 96G梯度PCR仪购自德国Analytik Jena公司，K5500型微量分光光度计购自北京凯奥科技发展有限公司。

1.4 建模及干预方法 将40只大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组，每组10只。制备大鼠ACF模型[5]：除对照组外，按照20 mg/kg的剂量给予其他组大鼠皮下注射二甲肼，对照组只注射等剂量生理盐水，均1次/周，连续注射15周。在首次给予二甲肼处理后第2天起，对照组、模型组给予5 mL/(kg·d)的生理盐水灌胃，TFL小剂量组、TFL大剂量组分别按100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)给予TFL灌胃，1次/d，直至实验第15周最后1 d，应用放血法处死大鼠。

1.5 ACF计数 取大鼠全部结直肠，并将肠组织沿肠系膜纵向切开，0℃磷酸缓冲盐溶液洗净，黏膜面朝上置于10%中性甲醛液中固定48 h。然后表面均匀喷洒0.2%的亚甲蓝溶液，将染色10 s后的肠组织于10倍放大的解剖镜下观察并计算ACF的数目。ACF判断标准：镜下见腺管开口明显扩大、上皮细胞层增厚，腺管之间间距增大，不规则的管腔，镜下可见轻微的隆起。

1.6 血清酶学检测 收集大鼠全血5 mL置于促凝管，4℃ 3 500 r/min离心10 min分离出血清，按照试剂盒说明书进行血清谷胱甘肽的检测。

1.7 mRNA水平检测 取大鼠ACF组织约5 mg，对照组取非ACF的肠道组织5 mg，应用RNA保存液冻存，加TRIzol在冰上匀浆裂解，按照总RNA提取试剂盒(柱式法)提取总RNA，使用无酶水将RNA从提取柱上洗脱，RNA微量定量仪测定浓度及纯度，采用反转录试剂盒将500 ng RNA反转录为cDNA。去除基因组DNA，将模板和上下游引物均稀释10倍后进行荧光定量PCR反应，反应体系为20 μL(SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μM引物1 10.5 μL,10 μM引物2 20.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL)，PCR反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 10 s，退火55℃ 15 s，共反应39循环，延伸72℃ 20 s。每个样本重复3次，同步设立空白对照。以β-肌动蛋白为内参，引物序列见表1。利用2-△△CT计算目的基因相对表达量，△CT=CT目的基因-CT内参基因。

表1 引物序列

1.8 统计学分析 使用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用TamhaneT2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 4组大鼠ACF计数比较 模型组大鼠结直肠出现直径约5 mm的ACF，对照组大鼠结直肠未发现有ACF病变。模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组大鼠ACF的数量依次下降(均P<0.05)，见表2。

表2 4组大鼠ACF计数及血清谷胱甘肽含量比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与TFL小剂量组比较，△P<0.05。

2.2 4组大鼠血清谷胱甘肽含量比较 模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组、对照组大鼠血清谷胱甘肽含量依次升高(均P<0.05)，见表2。

2.3 4组PD-1、NF-κBp65 mRNA的表达水平比较 模型组ACF中PD-1 mRNA的表达水平高于对照组及TFL大剂量组(P<0.05)，其余组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较，模型组NF-κBp65 mRNA的表达水平升高，而TFL大剂量组的表达水平下降(均P<0.05)；模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组NF-κBp65 mRNA的表达水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠ACF组织中PD-1、NF-κB p65 mRNA的相对表达水平比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与TFL小剂量组比较，△P<0.05。

3 讨 论

我国是结直肠癌的高发国家，每年新发病例超过25万，死亡病例约14万，均占全世界同期相应病例的20%左右[6]。研究表明，早期癌症患者治疗后5年生存率可提高到90%以上，而晚期结直肠癌患者术后5年生存率只有12%[7]。如何早期发现并处理病变，预防结直肠癌的发展是迫切需要解决的重大问题。近年来，天然植物中的抗肿瘤有效成分及其相关机制成为研究热点之一。

抗氧化剂抗肿瘤的机理主要通过抑制肿瘤相关基因和蛋白质表达，抑制脂质过氧化，减少肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，以阻止肿瘤的发生、转移、恶化。黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，是自然界广泛存在的一种较强的抗氧化剂[8]。黄酮类化合物除了具有清除自由基和抗氧化作用外，还可抗病毒、抗肿瘤及双向调节细胞凋亡[9]。TFL是从传统中药荔枝核中提取的黄酮类化合物的总称，是荔枝核中抗氧化的最主要成分。目前，尚缺乏有关TFL在肿瘤发生中作用的研究。本研究中，模型组大鼠结直肠出现直径约5 mm的ACF，提示使用二甲肼成功建造大鼠直肠癌癌前病变模型。给予一定剂量的TFL进行干预后，模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组大鼠ACF的数量依次下降(均P<0.05)，提示TFL可抑制大鼠结直肠出现ACF，且大剂量的TFL作用更佳。前期实验结果表明TFL有抑制体外HT29细胞增殖的作用[4]，因此，我们推测TFL对结直肠癌前病变的产生有一定的抑制作用。

谷胱甘肽可保持细胞膜结构的完整性及组织细胞免受损伤，反映了机体清除氧自由基的能力。有研究表明，黄芪总苷通过降低肝微粒体代谢酶CYP450的含量，提高谷胱甘肽活力，从而抑制大鼠结直肠ACF的形成[10]。亦有研究表明，七叶亭和七叶苷可抑制二甲肼引起的结肠DNA氧化损害过程，从而抑制ACF的产生[11]。本研究中，模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组大鼠血清谷胱甘肽含量依次升高(均P<0.05)，提示TFL在该模型中发挥了较好的抗氧化作用，且大剂量的TFL作用更佳。可见，作为一种强抗氧化剂，TFL具有减少ACF的作用,从而防止其进一步发展导致结肠癌发生。

NF-κB通路在结肠从炎症到癌变的过程中发挥极其重要的作用。炎症时脂多糖与Toll样受体4特异性结合后，下游NF-κB信号通路被激活：当NF-κB从细胞质转移到细胞核内，即被激活，随后进一步激活其他基因，引起细胞增殖，抑制细胞凋亡[12]。与NF-κBp50组成二聚体的NF-κB p65是NF-κB信号通路中的关键节点，NF-κBp65主要参与基因转录的起始调节。研究证实，当细胞受到肿瘤坏死因子、白细胞介素等外界因素刺激时，NF-κBp65从二聚体上解离而活化，持续活化的NF-κBp65可改变细胞正常的信号传导，促进细胞癌变[13]。而在肿瘤细胞中，NF-κBp65可促进肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的凋亡，促进血管新生，参与细胞外基质降解，提高肿瘤细胞的浸润转移能力[14]。我们在前期研究中发现，TFL对HT29细胞系有抑制其增殖的作用，且发现TFL干预后NF-κB mRNA和蛋白的表达均显著降低[4]，提示TFL通过干预NF-κB的转录和翻译过程来抑制HT29细胞增殖；且当NF-κB被抑制后其下游的白细胞介素1β表达亦减少，提示NF-κB可能为TFL抑制HT29细胞系增殖的关键因子。在本研究中，模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组NF-κBp65 mRNA的表达水平依次降低(均P<0.05)，提示TFL可降低二甲肼诱导的大鼠ACF中NF-κBp65 mRNA的表达，据此推断，TFL通过抑制NF-κBp65基因的表达来抑制大鼠早期结直肠肿瘤发生。

PD-1是在结直肠癌发病机理中参与免疫逃逸的关键基因。然而仅TFL大剂量组ACF中PD-1 mRNA的表达水平低于模型组(P<0.05)，而TFL小剂量组与模型组差异并无统计学意义(P>0.05)，TFL没有显示出较好的作用，可能是出于肿瘤早期尚未激活PD-1信号通路来促进肿瘤的生长。

综上所述，TFL对二甲肼诱导的大鼠结肠癌前病变具有良好的抑制作用，大剂量TFL的作用更佳；NF-κBp65可能为TFL抑制大鼠结直肠ACF发生、发展的关键因子，或可成为抑制肿瘤发生的潜在靶点。TFL可作为预防结直肠早癌的潜在药物，其机制需更进一步探索和研究。