桃仁在小鼠生理性月经样模型中对子宫内膜崩解的作用

陈西华 王尚明 王 宁 张 斌 张树成 徐祥波 贺 斌

国家卫生计生委科学技术研究所(北京，100081)

桃仁是中医用于治疗血滞经闭、 产后瘀滞腹痛、症瘕痞块等常用中药，具有活血祛瘀的作用。此外，中医还常采用桃仁配伍治疗或缓解子宫内膜异位症。前期研究中，已经逐渐明确了桃仁的抗凝血作用、抗血栓、抗炎与抗纤维化等药理作用，但与女性生殖生理相关的药理作用并不明确。桃仁在子宫中的作用和机制尚无深入系统的研究，与子宫、卵巢等生殖器官相关的有效化学成分等问题尚不清楚。本研究组建立的小鼠月经样模型是研究月经出血的良好“平台”[1-2]，可在保留子宫组织结构的前提下通过多种方式对动物进行干预，同时避免了人子宫内膜取样的限制与局限性，使得对月经的研究观察更加完整、细致与准确。本研究利用小鼠月经样模型，初步探索桃仁在月经发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPFII级13周龄NIH雄鼠与雌鼠各10只(本所实验动物中心提供)。小鼠在可控的条件下饲养，给予充足的水和食物。所有的实验步骤均获得国家卫生计生委科学技术研究所动物伦理委员会审查批准。

1.2 药品与试剂

桃仁粉末(购自陕西森弗高科实业有限公司)用生理盐水配制成6mg/ml注射液；花生油(鲁花牌)；常规石蜡切片，HE染色。

1.3 研究方法

1.3.1小鼠月经样模型的建立[2]将雌鼠与结扎输精管的雄鼠交配，次日中午12:00见栓计为0.5d，3.5d小鼠子宫宫腔内注射15μl花生油，以诱导子宫内膜发生蜕膜化。蜕膜化诱导48h后即4.5d，切除小鼠双侧卵巢，引发孕酮(P4)撤退，此时计为P4撤退0h。其后24h内，小鼠子宫内膜发生崩解出血，蜕膜化子宫内膜基质细胞逐渐坏死，从宫腔脱落并排出。在P4撤退后，子宫内膜崩解强度逐渐增高，到24h最高，定义P4撤退的0～24h期间为崩解期。

1.3.2分组与处理将小鼠月经样模型分为桃仁组与空白对照组各5只。桃仁组小鼠从3.5d 12:00，即P4撤退-2d开始，间隔24h，分4次腹腔注射给予桃仁注射液，剂量为30mg/(kg·次)。对照组小鼠以同样的方式腹腔注射等体积生理盐水。两组小鼠均在P4撤退后24h处死并取子宫。在P4撤退后24h内给药前对所有小鼠进行阴道细胞学涂片观察阴道出血，确定小鼠月经样模型成功建立。

1.3.3小鼠子宫大体形态与组织形态学观察取材后，对子宫大体拍照，随后立即用4%多聚甲醛固定且≥24h，常规石蜡切片、HE染色，显微镜下观察组织形态学变化并拍片。

1.3.4小鼠子宫观察与统计学分析利用图像处理软件，手动截取小鼠子宫横切切片中蜕膜化组织面积与崩解区域面积，统计充血区域的面积。分别计算崩解区域及充血区域在蜕膜化组织中的占比。将对照组与桃仁组中相对崩解面积与相对充血面积进行统计学分析，并进行t-test检验。P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 阴道出血

桃仁组与对照组小鼠均在P4撤退后12～24h子宫组织切片中观察到出血，其中16～24h出血量较多。

2.2 子宫大体与组织形态学

对照组小鼠子宫大体形态较粗，呈暗红色或深红色。小鼠子宫组织切片观察，内膜蜕膜化区域细胞大部分为陈旧性坏死，绝大多数细胞的细胞核呈现固缩状，细胞质完全溶解，细胞界线消失，坏死的子宫内膜组织与子宫基底层有明显的分离带。崩解的子宫内膜脱落区域，基底层无上皮被覆，呈裸露状态。桃仁组小鼠子宫颜色较对照组深，呈深红色或红黑色。组织形态学观察子宫内膜蜕膜化区域大面积崩解，蜕膜化细胞陈旧性坏死，表现为细胞核固缩，细胞质溶解且无法辨别细胞界线，崩解的子宫内膜组织与基底层有明显的分离带。与对照组相比，桃仁组子宫内膜中血管扩张明显，崩解的蜕膜化组织，以及崩解组织外围的基底层，均有大量红细胞渗出，广泛分布于这些区域的细胞之间，且桃仁组的红细胞渗出的区域范围远大于对照组。桃仁组全部表现出显著的红细胞渗出，而对照组均未观察到崩解组织边缘区域的红细胞渗出现象。见图1。

对照组相对崩解面积平均值76.5%，桃仁组为66.8% ，二者比较无统计学差异(P=0.343)。见图2。对照组相对充血面积平均值6.2%，桃仁组11.3%，绝大多数相对充血面积高于10%，最高达到15%。桃仁组小鼠子宫充血程度显著高于对照组(P=0.009)。见图3。

(A)：对照组子宫大体 (B)：对照组组织形态低倍图(标尺400μm) (C)、(B)：方框区域高倍图(标尺50μm) (D)、(G)：桃仁处理组子宫大体 (E)、(H)：桃仁处理组组织形态低倍图(标尺400μm) (F)、(E)：方框区域高倍图 (标尺50μm) (I)、(H)：方框区域高倍图(标尺50μm) 图1 小鼠月经样模型空白对照组与桃仁药物处理组子宫大体形态与组织形态学

相对崩解面积=崩解面积(虚线)/ 蜕膜化面积(实线) 图2 小鼠月经样模型子宫切片(HE)

相对充血面积=充血面积/蜕膜化面积图3 小鼠月经样模型子宫组织切片(HE)

3 讨论

月经异常与产后瘀阻是常见的妇科疾病，表现为闭经、痛经、产后腹痛、恶露不尽、症瘕积聚等。目前西医主要以激素调节治疗[3]。而中医采用活血化瘀的中药进行调理，不易产生副作用。桃仁为常用活血化瘀药，具有疏通血脉 、祛除瘀血之功效。本研究利用小鼠月经样模型探索桃仁对月经发生中子宫内膜的作用。

桃仁的药理作用主要体现在改善血流动力学，抗凝血，抗炎抗过敏等，但是分子机制还不十分清楚。目前已在多种动物实验中证实，桃仁能够降低血管阻力，促进股动脉与心脑血管、肝脏等器官内微循环血流速度，同时还能增加灌流液的流量，改善血流动力学[4]。本研究在小鼠月经样模型崩解期给予桃仁后，子宫内膜中的血管扩张明显，且崩解的子宫内膜外缘红细胞渗出显著增强。早期研究发现，桃仁能够显著提高假孕小鼠子宫血管中前列腺素F2α(PGF2α)的含量[5]。本研究组在此前研究发现，小鼠月经样模型崩解过程中，环氧合酶2(COX-2)通过调节PGF2α的升高，提高血管通透性，进而促使崩解过程中的白细胞侵润[6]。提示桃仁可能通过相似信号通路增强血管内皮细胞的通透性，导致红细胞大量渗出进入组织细胞间隙。桃仁还具有抗凝血功能，桃仁的乙酸乙酷提取物能延长小鼠的凝血时间[7]。桃仁水提物对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集具有显著的抑制作用，聚集抑制率达到93.09% ，与空白对照组差异显著[8]。此外，桃仁配伍的还能够降低血液黏稠度与红细胞压积[9]；抵抗低密度脂蛋白(LDL)氧化、改善高胆固醇血症的作用，这可能与抗血小板聚集和抗血栓形成作用有关[10]。提示是本研究中大量红细胞呈弥散状态的原因之一。目前，中医应用桃仁配伍的中药治疗或缓解子宫内膜异位症症状。除此之外，尚无桃仁与子宫内膜相关的研究报道，应进一步深入研究。

本研究以小鼠月经样模型为基础，初步揭示了月经发生中，桃仁能够促进红细胞在组织中，特别是崩解区域外缘和基底层区域的渗透，提示桃仁可能通过PGF2α增强血管内膜通透性。此外桃仁可能参与了改善血流动力学、抗凝血等作用。桃仁作为活血化瘀的常用中药，与妇科相关的药理作用及作用机制还有待深入研究。