氧化铝柱层析纯化蛋黄多不饱和脂肪酸卵磷脂及其脂肪酸组成分析

龚金炎 靳羽晓 王静静 李归浦 何光华 袁海娜 李 玲刘士旺 尤玉如 肖功年*

（1 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室 浙江科技学院生物与化学工程学院 杭州310023 2 贝因美婴童食品股份有限公司 杭州310053）

卵磷脂即磷脂酰胆碱（PC）是动植物细胞膜的基本组分。 长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）对生物膜和机体的正常生理活动与代谢有重要调节功能，主要包括花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，具有良好的乳化、分散、粘着等特性[1-3]，已被广泛应用于食品、医药、保健、化妆品、饲料等行业中[4-5]。许多科研组织和权威机构包括联合国粮农组织及世卫组织建议成人从饮食中摄入的EPA 和DHA 总量应在250 mg/d～2 g/d 之间[6]。 婴儿配方食品中的总脂肪酸应该包含至少0.2% DHA 和0.35% ARA。 随着人们对保健养生的日益重视，市场上对高纯度PC 的需求逐年增加。我国高纯度PC 的生产技术水平相对落后， 特别是富含长链多不饱和脂肪酸的高纯度PC，主要靠进口，贸易逆差巨大[7]。 进一步优化PC生产工艺， 开发出富含长链多不饱和脂肪酸高纯度的PC 产品，对满足不断增长的市场需求具有重要意义。

目前，我国PC 分离纯化方法主要有：有机溶剂萃取法、乙醇冷冻法、超临界流体法、金属盐沉淀法、膜分离法及柱色谱法等[8-10]。 国内已有学者[11-14]采用氧化铝层析柱纯化制备高纯度PC，而未对柱层析过程中的影响因素进行考察。 本试验以90%乙醇为萃取剂制备的PC 粗品为原料，结合薄层层析法和高效液相色谱对95%乙醇洗脱PC 的分离纯化工艺进行研究， 并通过气相色谱法对所得产品进行脂肪酸分析，以期为PC 的工业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋黄卵磷脂粗品， 实验室自制 （PC 纯度为71.63%±2.73%）；蛋黄卵磷脂标准品（纯度＞99%）P3556、37 种混合脂肪酸甲酯标准品、 异辛烷（AR），sigma 公司；氯仿、无水乙醇、三乙胺、甲醇、丙酮、氢氧化钾、硫酸氢钠均为分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；100～200 目中性氧化铝、200～300 目中性氧化铝，国药集团化学试剂有限公司；丁基羟基茴香醚，购自Aladdin （阿拉丁）；甲醇色谱纯，德国默克色谱纯试剂公司。

1.2 仪器与设备

层析柱（Φ2.6 cm×60 cm），上海厦美生化科技发展有限公司；BT50S 蠕动泵，保定雷弗流体科技有限公司；循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；N-1100 旋转蒸发仪， 东京理化器械株式会社； 低温恒温槽， 上海百典仪器设备有限公司；UPK-1-5T 优普系列超纯水器，成都超纯科技有限公司；AB135-S 十万分之一电子天平，METTLER TOLEDOG；F254（5 cm×10 cm）硅胶板，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品； GC-2014，配有FID 检测器，日本岛津公司；Waters e2695 HPLC 系统，配有Waters 2489 检测器，美国waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料制备 称取一定质量的蛋黄粉，以90%乙醇浓度液料比9∶1（V/m），30 ℃条件下提取30 min，过滤后，滤液50 ℃旋转蒸发，0 ℃丙酮超声洗脱，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 层析柱准备 称取一定质量氧化铝， 置于140 ℃烘箱内活化6 h，干燥器中冷却至室温；称取适量活化后的氧化铝， 加入95%乙醇洗脱液浸泡2 h，湿法装柱后，静置过夜使其自然沉降完全。 上柱前需要调至所需条件，平衡30 min 以上。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 薄层层析法 （TLC）将硅胶板置于105℃烘箱中活化2 h， 干燥器中冷却至室温备用；所需测定样品分别点样；层析缸中使用展开剂（氯仿∶无水乙醇∶三乙胺∶水= 10∶11.3∶11.7∶2.7）展开8 cm， 晾干后， 溴百里酚蓝染液均匀喷于薄板表面，通风橱晾干，可见浅绿色斑点，并确定相同Rf值为同一物质。

1.3.3.2 高效液相色谱（HPLC）检测方法 色谱柱：安捷伦ZORBAX RX-SIL（250 mm×4.6 mm，5 μm），进样量：10 μL，检测波长：206 nm，柱温：35℃；流动相A：甲醇∶水（8∶1）；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～6 min，60%～48% A，40%～52% B；6.01～10 min，60% A，40% B。

1.3.3.3 气相检测 （GC）方法 色谱柱：DIKMA DM-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm），具体操作方法参见GB 5009.168-2016。 分流比调整为30∶1。

1.3.4 单因素试验 称取一定质量蛋黄卵磷脂试样上样后，不同浓度乙醇洗脱，以每0.5 BV （0.5倍柱体积）单位收集，利用TLC 快速定性和HPLC定量分析相结合跟踪。 填料量为270 g 氧化铝，固定其他条件，分别考察上样量（4，6，8，10 g）、上样浓度（w/v）（1∶4、1∶10）、 洗脱液浓度（90%乙醇、95%乙醇、纯乙醇）、流速（4，6，8 mL/min）及固定相粒度（100～200 目、200～300 目）等因素对PC 纯化过程的影响，每组试验平行3 次。

1.3.5 最优条件下洗脱效果的检测和脂肪酸分析在最优条件下：洗脱剂浓度为95%乙醇，上样量为0.0222 g/g 氧化铝 （6 g）， 洗脱流速为8 mL/min，上样浓度为1∶4（m/V）。 对洗脱液进行分段收集浓缩、经氮气吹干（30 ℃），由高效液相色谱检测PC 含量和气相色谱分析脂肪酸种类， 每组测量3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 薄层层析结果

分别对PC 粗品、PC 标品、前期洗脱液和后期洗脱液进行点板显色，结果见图1。 图中显示柱层析纯化效果明显， 粗磷脂中的5 种磷脂成分得到了有效分离，可得到纯度较高的PC 产品；同时也可以看出后期洗脱液中，PC 以外的其它杂质。

图1 薄层层析结果Fig.1 Thin layer analysis results

2.2 PC 标准曲线

通过外标法计算样品卵磷脂含量， PC 含量与色谱峰面积关系的标准曲线为Y= 2 782.6X+228 753，R2=0.9983， 在0.078～2.5 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.3 单因素试验

2.3.1 固定相粒径对洗脱过程影响 以100～200目和200～300 目的中性氧化铝为填料， 以确定固定相粒径对洗脱过程的影响。

由图2 可知，200～300 目的氧化铝吸附能力更强，PC 洗出时间稍晚；200～300 目氧化铝较100～200 目的纯化效果稍弱，这是由于PC 分子质量处于600～700 u 左右，分子较大，所以孔容较大的吸附剂分离纯化效果更好[15]。 另外，试验发现氧化铝粒径为200～300 目时，由于填料粒径小，层析柱装填过于紧密，导致洗脱压力增大，对蠕动泵的压力过大。综合考量各种因素，选用氧化铝填料的粒径为100～200 目。

2.3.2 上样浓度对洗脱过程的影响 上样不同浓度1∶4 和1∶10（w/v），以确定不同上样浓度对洗脱过程的影响。

由图3 可知，在相同上样量的前提下，上样浓度越浓，洗脱带越窄，越易洗脱；上样浓度稀时，洗脱带较宽，造成洗脱液的浪费；浓度更大时溶解不完全。 因此，选取的上样浓度为1∶4（w/v）。

2.3.3 不同上样量对洗脱过程的影响 以4，6，8和10 g 为上载量，以确定不同上载量对洗脱过程的影响。

由图4 可知，上载量为4 g 时，吸附剂太少，无法充分利用，浪费层析柱填料，同时流动相耗量太大，且产品干燥能耗大；而上载为10 g 时，上载量过大，TLC 结果显示洗脱液无单一斑点，此时层析柱负载过大， 导致无法实现目标产物与杂质的有效分离。上样量为8 g 时，TLC 单一斑点较少，上载量为6 g 时单一斑点量最多， 此时分离效果最好。

2.3.4 洗脱流速对洗脱过程的影响 以4，6 和8 mL/min 为洗脱流速，确定不同洗脱流速对洗脱过程的影响。

图2 不同中性氧化铝粒径洗脱曲线Fig.2 Elution curves of different diameter neutral alumina

图3 不同上样浓度洗脱曲线Fig.3 Different sample concentration elution curves

图4 不同上载量时洗脱曲线Fig.4 The washout curve of different loads

图5 不同洗脱流速时洗脱曲线Fig.5 Elution curve of different washout velocity

洗脱流速对于LPC 含量的控制起着至关重要的作用。 由图5 可知， 洗脱流速为4 mL/min，TLC 结果显示PC 单一斑点少且PC 洗脱时间较长， 同时由于PC 在氧化铝柱中停留时间过长，会有部分的PC 分解转化为溶血磷脂酰胆碱（LPC）[16]。当洗脱流速在6 mL/min 及以上时，LPC 含量得到有效的控制。在同样的洗脱效果下，洗脱流速应选尽可能大， 以节省洗脱时间， 由于蠕动泵转速限制，试验没有做更高流速的考察，本试验的最佳洗脱流速选用8 mL/min。

2.3.5 不同洗脱剂浓度对洗脱曲线的影响 选用90%乙醇、95%乙醇和纯乙醇为洗脱剂， 以确定不同洗脱流速对洗脱过程的影响。

由图6 可知，当以无水乙醇作为洗脱液时，氧化铝活性很高，对磷脂的吸附作用太强，洗脱谱带变宽， 造成洗脱液浪费。 而当洗脱液为90%乙醇时，由于洗脱液含水过多，氧化铝的活性中心与水结合从而降低其活性， 且含水量过高产品难以干燥；当活性降低到合适值时，可达到目标物与杂质的有效分离。 故本试验选用的95%乙醇纯度为洗脱液。

2.4 最优条件下洗脱效果

2.4.1 PC 产品含量和得率 由图7 和表1 可知，蛋黄卵磷脂含量先升高后下降低，这是由于PC 在氧化铝上吸附力较弱，比较容易洗脱，前期洗脱液中PC 含量较高；随着洗脱液体积的增加，PC 逐渐被洗脱完全，其它磷脂如PE、PI 等随之被洗脱，同时也有部分PC 分解成LPC[16]， 因此，PC 含量下降。

图6 不同洗脱剂浓度时洗脱曲线Fig.6 Elution curve of different eluent concentration

图7 最优条件下洗脱曲线Fig.7 Optimal elution curve

图8 HPLC 图谱Fig.8 HPLC results of different samples

表1 最优条件下层析产品结果Table 1 The optimal conditions for the analysis of product results

紫外检测器具有选择性， 只对具有π 键和孤对电子的物质有响应， 其响应值因物质所含官能团及其官能团连接方式的不同而异[17]。 蛋黄来源磷脂中脂肪酸组分常因家禽的品种和饲料中脂肪酸组分的不同而有所差异[18]，不同脂肪酸组分对紫外检测的响应差异很大，因此，采用UV 检测蛋黄磷脂时会出现PC 含量大于100%的现象。 由试验结果随着洗脱液体积的增加，PC 的纯度及产量均有所降低。

2.4.2 PC 产品脂肪酸分析 由层析样品的GC 检测结果见表2，各段层析样品中，脂肪酸种类大致相同，所有层析样品均含有棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、 油酸、 反式亚油酸、 亚油酸、DHA、EPA、ARA。 各层析样品中的饱和脂肪酸（SFA）含量随洗脱时间的不同变化不大，含量在46%左右，其中棕榈酸含量最高；随着洗脱时间的增加，单不饱和脂肪酸（MUFA）含量逐渐增加，由一段产品27.40%增加到34.19%； 多不饱和脂肪酸（PUFA）含量逐步减少， 由一段产品的29.07%降到18.06%。 PUFA 主要由n3 及n6 多不饱和脂肪酸构成其中主要的功能性脂肪酸有DHA、EPA、ARA，一段层析样品中DHA 含量高达13.94%，该结果远高于其他禽蛋黄PC 中的检测结果[19]，随着洗脱时间的延长DHA 含量逐渐减少， 由13.94%降至8.28%；ARA 变化趋势与EPA 相似， 前三段样品的ARA 含量变化有减少趋势，由1.79%降到1.07%，EPA 含量由1.74%降至1.37%， 结果表明该方法可制得高纯度PC 的同时， 还对FA 中的PUFA 组成有一定的筛选作用。

表2 不同层析产品脂肪酸组成GC 分析结果Table 2 Fatty acid composition of different chromatographic products meteorological analysis results

3 结论

采用以乙醇为洗脱剂， 研究中性氧化铝层析制备高纯度多不饱和脂肪酸蛋黄卵磷脂方法。 本试验采用的洗脱曲线能清晰表示出各条件下PC的洗脱效果， 试验过程中采用薄层层析法进行定性分析，高效液相色谱法对洗脱液进行定量分析，快速，简便，直观，准确。 试验结果表明：最佳工艺条件为氧化铝粒径为100～200 目， 洗脱液为95%乙醇，洗脱流速为8 mL/min，色谱柱负载量为0.0222 g/g 氧化铝， 上样料液比为1∶4 条件下PC的纯化效果最好，从71.63%±2.73%的蛋黄卵磷脂粗品纯化得到纯度达90%以上的卵磷脂得率达84.43%； 层析产品中的一段产品的PUFA 含量最高可达29.07%，其中DHA 的含量更是高达13.94%。该研究结果可为工业化制备高纯度PC 以及高DHA 含量产品提供数据支撑和参考。