薄层色谱与表面增强拉曼光谱联用快速检测辣椒油高脂肪基质中的苏丹红

2019-07-30扈晓鹏符云鹏方国臻

中国食品学报 2019年6期

佟蕊齐颖扈晓鹏符云鹏方国臻王硕

（天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室天津300457）

苏丹红染料本应用于化工染色，然而有些不法商家将其添加到辣椒制品中来增加产品的外观新鲜度，以此吸引消费者[1-2]。苏丹红染料属于偶氮类染料，具有遗传毒性和致癌性，食用含苏丹红的辣椒制品会对人体产生危害。目前检测苏丹红染料常用的方法有高效液相色谱法（HPLC）[3]、液相色谱-质谱联用法[4]、气相色谱-质谱联用法（GCMS/SIM）[5]，虽然这些检测方法灵敏度高，但非常耗时，不能实现现场的快速检测。研究开发能够实现现场快速检测的方法具有重要意义。薄层色谱（TLC）能够用于分离复杂成分，并且有操作简单，分离速度快，成本相对低廉的优点[6]。 TLC 分析方法灵敏度较低，而表面增强拉曼光谱（SERS）方法具有灵敏度高，检测快速的优点，可以实现定性和半定量检测[7]。

本文建立了TLC-SERS 联用检测辣椒油中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的方法，对薄层色谱分离条件和拉曼光谱检测条件进行优化，由于辣椒油油脂含量高，所以采用固相萃取（SPE）进行前处理，去除油脂和杂质，有效净化样品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料和试剂苏丹红Ⅰ～Ⅳ标品，购于AccuStandard Inc.；抗坏血酸（VA），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），氯金酸（HAuCl4·3H2O），购于Sigma-Aldrich；其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

薄层色谱硅胶板GF254，购于青岛海洋化工分厂；氧化铝薄层色谱板AGF254，购于上海盛亚化工厂；硅胶薄层色谱板SG，购于济南赛畅科学仪器有限公司；苏丹红Ⅰ～Ⅳ专用萃取柱（Cleanert Sudan），购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。 4 种不同品牌的辣椒油购于天津超市。

1.1.2 仪器显微共聚焦拉曼光谱仪，Renishaw。拉曼光谱检测条件激发波长为785 nm，激发功率为100 mW，曝光时间10 s，扫描区间为500～2 000 cm-1，5 次累积扫描。

在JEM-2010FEF 透射电镜上200 kV 条件下观察所制备的基底。

1.2 试验方法

1.2.1 基底的制备

基底一：银溶胶的制备

将150 mL 浓度为0.02%的硝酸银溶液放入微波炉中加热至沸腾，之后逐步滴入4 mL 1%柠檬酸三钠溶液，立刻再加热2 min，混合溶液剧烈沸腾后，取出冷却[8]。

基底二：金纳米粒子（GNPs）的制备

采用柠檬酸钠还原的方法[9]并做了适当调整。

量取浓度为25 mmol/L 的氯金酸2.039 mL，加入47.961 mL 的去离子水混匀煮沸后，加入8 mL 1%的柠檬酸三钠，溶液变为深红色后继续煮沸5 min，遮光，降温后置于4 ℃冰箱中保存。

基底三：金纳米棒（GNRs）的制备

采用晶种生长法进行GNRs 的合成，具体方法主要参考前人的方案[10-12]，并做了适当的调整。

种子液的制备：将7.5 mL 0.1 mol/L 的CTAB、250 μL 的10 mmol/L 的氯金酸溶液混合，充分搅匀，加入600 μL 的0.01 mol/L 的硼氢化钠溶液。

生长液的制备：量取4.75 mL 0.1 mol/L 的CTAB、200 μL 10 mmol/L 的氯金酸溶液和30 μL的0.004 mol/L 硝酸银溶液，混匀后振荡7 min，再加入32 μL 0.1 mol/L 的抗坏血酸溶液，振荡40 s。

量取10 μL 放置2 h 的种子溶液，加入到生长液中，振荡30 s，然后遮光静置24 h 后，避光置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 样品前处理模拟阳性样品的制备及前处理：配制质量浓度为1 000 mg/L 的苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品溶液（正己烷为溶剂），根据浓度需要进行适当的稀释，添加到经高效液相色谱检测不含苏丹红的0.5 g 辣椒油中，使辣椒油中苏丹红的加标浓度分别为0.100，1，5，10，25，50，100，200 mg/kg，充分混合后，静置过夜。

将0.5 g 模拟阳性样品和实际样品分别加入3 mL 正己烷提取苏丹红。

将上述苏丹红正己烷提取液加到分别用三氯甲烷和正己烷各5 mL 活化后的SPE 柱中，3 mL 3%异丙醇-正己烷溶液淋洗SPE 柱后，加入3 mL三氯甲烷洗脱苏丹红。洗脱液用氮气吹至近干，用1 mL 正己烷复溶，待测。

1.2.3 检测方法将苏丹红标准溶液、辣椒油经SPE 处理后的待测溶液各5 μL 滴在薄层色谱板上，以正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮=100 ∶8 ∶6（体积比）为最佳展开剂进行TLC 分离；用显微共聚焦拉曼光谱仪检测滴加基底的斑点。使用WiRE 3.4 进行光谱收集和基本处理，Origin 8.5.1 软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 薄层色谱板的选择

为了考察薄层色谱板拉曼背景光谱是否会对测定目标物产生干扰，本试验选取了3 种不同材料的薄层色谱板GF254，AGF254，SG 进行研究。AGF254含有氧化铝和荧光剂，GF254含有硅胶和荧光剂，SG 含有硅胶不含荧光剂。分别测定3 种薄层色谱板普通拉曼光谱图及滴加2.5 μL GNRs 后的拉曼光谱图，由图1 可知硅胶板AGF254与硅胶板GF254普通拉曼图谱区别不大，在～1 013 cm-1处都有很强的拉曼峰。但是滴加增强基底GNRs 之后，两者拉曼图谱有很大的差别：GNRs 对薄层色谱板GF254的拉曼峰有增强作用，但是对薄层色谱板AGF254有猝灭作用。对于薄层色谱硅胶板SG，不论普通拉曼光谱还是表面增强拉曼光谱其拉曼背景峰对目标物的检测影响都不大。所以由上可以看出本试验可用薄层色谱板SG 和薄层色谱板AGF254，因为苏丹红染料本身就有荧光，不需要紫外照射也能看到斑点，而且薄层色谱板SG 比薄层色谱板AGF254价格便宜，所以试验最终选择硅胶板SG。

本试验采用王群、潘文慧等[13]在测定眼影中苏丹红的薄层色谱分离条件即正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮= 100 ∶8 ∶6 （体积比）进行薄层色谱的分离。

2.2 不同基底对苏丹红拉曼光谱增强效果的考察

图1 不同类型的薄层色谱板的普通拉曼光谱图（a）和表面增强拉曼光谱图（b）Fig.1 Normal （a）and SERS （b）spectra of three of TLC Plates

研究比较了银溶胶、GNPs、GNRs 3 种不同的拉曼增强基底，在薄层色谱板SG 上滴加质量浓度为200 mg/L 苏丹红Ⅰ，再分别滴加2.5 μL 的3种基底，测得拉曼光谱，如图2 所示。由图2 可知，GNPs 和GNRs 的增强效果比银溶胶增强效果好，以GNPs 作为增强基底，能微弱的看到苏丹红Ⅰ的特征峰1 597，1 551，1 496，1 448，1 386，1 341，1 260，1 228，1 168，989 cm-1，而从GNRs 增强的苏丹红Ⅰ拉曼图谱可以很明显地看到特征峰，由此可见GNRs 的增强效果最好。目前SERS 增强机制大体有两种，一种是化学机制，分子与底物之间发生电荷转移[14-15]；另一种是电磁场理论，是由于局部表面等离子激发增强效果与表面等离子振动（LSPR）有关[16-18]。由此分析并猜测可能有以下两点原因：一是因为相对银溶胶，苏丹红染料更容易与GNPs 和GNRs 相互作用，从而使拉曼信号增强；二是因为金纳米晶体能够将自由空间光的子波长集中起来并连接在它的表面，使得金纳米晶体周围有很强的电磁场增强作用[19-21]，进而使拉曼信号增加，造成GNPs 和GNRs 比银溶胶增强效果好；此外，GNRs 相对GNPs 存在巨大的优势就是它独具两种LSPR：一种是纵向LSPR，是由电荷振动引起的；另一种是横向LSPR，是由于横向光的偏振导致的[22]。本试验GNRs 基底增强效果好，猜想可能是由于GNRs 的纵向和横向LSPR 共同作用使得拉曼信号增大的强度比GNPs 只存在一种LSPR 增强效果所致。

图2 2.5 μL 的不同基底滴加在200 mg/L 的苏丹红Ⅰ标准溶液上的光谱图Fig.2 SERS spectra of 200 mg/L SudanⅠstork solution with 2.5 μL silver colloids （a）， GNRs （b）and GNRs （c）respectively on SG plates

2.3 滴加GNRs 次数的考察

分别以一次，两次，三次将2.5 μL GNRs 滴加在经过薄层色谱分离的苏丹红Ⅰ斑点上（浓度为100 mg/L）。由图3 可见，滴加次数对拉曼光谱强度有显著影响，总量保持不变，分两次滴加比一次滴加拉曼光谱增强效果好，但并不是滴加次数越多越好，两次以后增强效果减弱。猜想可能有以下原因：随着滴加次数增多，GNRs 逐渐在目标物上完全形成单层覆盖，导致拉曼信号增强，但是滴加次数过多，超过了单层覆盖，达到多层覆盖反而会影响拉曼信号强度，使得拉曼信号强度降低；另一种原因可能由于增加滴加次数，使金纳米粒子之间相互作用聚集，适当的聚集会增强拉曼信号，过度的聚集会使信号减弱[23]。所以本试验选择滴加次数为两次。

2.4 模拟阳性样品的检测与数据处理

对苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品混合溶液进行TLC 分离，分两次滴加2.5 μL GNRs 基底，拉曼光谱仪检测，得到图4。由图4 可见，苏丹红染料明显的分离并得到对应的拉曼光谱。其拉曼光谱分别与苏丹红Ⅰ～ Ⅳ标准品拉曼光谱进行对照，可知4 个点从上到下依次为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅲ。

图3 2.5 μL 的金纳米棒的不同滴加次数的苏丹红Ⅰ拉曼光谱图Fig.3 The SERS spectra of 100 mg/L SudanⅠwith different adding times of 2.5 μL GNRs on SG plates

图4 苏丹红标准混合液经过薄层色谱分离并拉曼光谱检测Fig.4 SudanⅠ～Ⅳstandard mixture solution after TLC and their spectra respectively

对含不同浓度苏丹红的辣椒油模拟阳性样品进行固相萃取除杂，TLC 分离，分两次滴加2.5 μL GNRs 基底，用拉曼光谱仪检测，过程如图5，得到的拉曼光谱如图6。图6 表明，在一定浓度范围内随着苏丹红染料浓度的降低特征峰拉曼信号强度减弱。由图6A 很明显的看出随着苏丹红Ⅰ浓度降低，其特征峰1 597，1 551，1 496，1 448，1 386，1 341，1 260，1 228，1 168，989 cm-1信号强度随之减弱，其中1 597 cm-1可能由苯环C-C 键剪切或者N=N 键伸缩引起的，1 496 cm-1可能由苯环平面的C-H 弯曲或N=N 拉伸或苯环的C-C 拉伸引起的[24]。当苏丹红Ⅰ浓度低至为1 mg/kg 时，仍然可以看到其特征峰的出现，所以苏丹红Ⅰ的最低检出限为1 mg/kg。同样由此可以看出苏丹红Ⅱ主要特征峰为1 610，1 496，1 381，1 342，1 240，1 225 cm-1，其最低检出限为1 mg/kg。苏丹红Ⅲ主要特征峰为1 597，1 500，1 465，1 443，1 419，1 389，1 337，1 233，1 138 cm-1；苏丹红Ⅳ在1 599，1 473，1 384，1 229，1 200，1 170，1 098 cm-1位置存在特征峰，最低检出限都为0.100 mg/kg。