海参低温处理品质与理化性质研究

贺宝玉 冯丁丁 蒋 迪 白 颖 董秀芳 启 航*

（1 大连工业大学食品学院 辽宁大连116034 2 国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连116034）

海参营养价值极高， 具有许多生理和药理活性，2017年我国的海参产量达到22 万t[1]。 海参的嫩度是产品质量的重要指标之一， 影响海参加工的品质。海参在加工过程中存在质地变硬，或软烂的问题，且容易发生自溶，尤其是受到外部刺激如紫外线刺激等[2-3]。前期的研究发现氧化物质、内源酶的作用对肉品的硬度、口感、风味、营养价值产生较大的影响， 特别是活性氧 （Reactive Oxygen species，ROS）具有高度的化学反应活性，使细胞结构和功能受到损坏[4]，也会引起海参发生氧化损伤[5-6]。脂质过氧化不仅发生在生物体中，在食品加工及贮藏过程中也常常伴随发生， 从而影响食品的品质[7]。 蛋白降解会导致蛋白质的结构发生变化，蛋白质的氧化会对肌肉组织造成不良的影响。研究发现意大利白猪肉品质与cathepsin L 和cathepsin S 相关联，这两种内源酶会对肉的嫩度、弹性产生影响[8]。组织蛋白酶L 和钙蛋白酶在该嫩化过程中起较重要作用， 在肌肉嫩化中的作用已被广泛证明[9]。 低温处理能引起体内ROS 的生成、内源酶活力的提高、脂质的氧化，这些都成为影响低温嫩化产品品质的因素。然而，关于海参品质与内源酶、 蛋白质降解、 自由基生成的研究鲜见报道。本文围绕品质与理化性质变化研究，以期为海参低温加工获得良好品质产品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料 鲜活海参，购自大连市刘家桥市场，平均长度（17.5±2.5）cm。

1.1.2 主要试剂 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），3-[（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）和苯甲基磺酰氟（PMSF），购自Sigma；四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸钠（SDS）、聚丙烯酰胺（Acry）、过硫酸铵（APS）、二硫苏糖醇（DTT），购自上海生工生物工程有限公司；二甲基亚砜（DMSO），购自国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器、设备

ATTO 垂直电泳槽 （AE-6500），ATTO；ATTO电泳仪电源（AE-8135），ATTO；凝胶成像仪（MFChemiBIS 2.0），KOOLANCE；F-2700 型荧光分光光度计，日立高新技术公司；M20 型酶标定量测定仪， 瑞士Tecan Infinite 公司；ZKBTES-55 型真空冷冻干燥机，Virtis USA；A200 型； 电子自旋共振波谱仪（ESR），德国BRUKER 公司；数显匀浆机（T25），德国IKA 集团。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理 将鲜活海参宰杀去脏、去筋，切割后每3～5 块分装于玻璃皿中置于20 ℃恒温箱中分别放置1/24，1/4，1/2，1，2，3，4，5，6 d，没有经过任何处理的新鲜海参作为对照 （0 d），-80 ℃冰箱中储存备用。

1.3.2 L-羟脯氨酸含量测定 称取不同处理时间的海参各10 g，加入10 mL 蒸馏水，放于80 ℃水浴锅中水浴2 h（隔30 min 摇匀1 次），于1 500 xg离心30 min，取上清液过滤，取0.5mL 滤液加至水解管中，再加入3 mL 3.5 mol/L 的硫酸，于105 ℃烘箱中水解16 h，取出冷却至室温，加水稀释至5 mL，取1 mL 上述稀释液过滤再加入1 mL 3 mol/L的NaOH ，混匀后取0.5 mL 上述溶液置于1.5 mL EP 管中，加入0.25 mL 氧化液，混匀。室温放置20 min 后，加入0.25 mL 显色液，混匀后用锡纸包好置于60 ℃中放置15 min，再用流水冷却3 min，取200 μL 用酶标仪测定在558 nm 下的吸光值，代入标准曲线（y = 0.0721x + 0.0591，R2= 0.999）求含量。

1.3.3 质构测定 不同处理时间的海参各取3～5块（约1.5 cm × 1.5 cm）进行TPA（Texture Profile Analysis）分析。 样品置于测试平台上，于室温下进行测定。TPA 测试探头为P/50。测试条件如下：测前速率、测试速率与测后速率均为 1 mm/s；压缩程度70%；停留间隔5 s；触发值5 g。

1.3.4 SDS-PAGE 不同处理时间的海参体壁组织与裂解液（含20 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA -2Na，10 mmol/L DTT，1% Triton X-100，0.1% SDS）1∶3 比例混合，冰浴中研磨提取全蛋白；然后4 ℃，12 000xg 条件下离心15 min。 根据样品的蛋白浓度用SDSPAGE 的5×上样缓冲液 （含0.25 mol/L pH 7.5 Tris-HCl，8 mol/L 尿素，5% SDS，5% β-巯基乙醇）按一定比例稀释，沸水浴煮5 min，冷却后离心。使用5%浓缩胶和10%分离胶跑电泳。 电泳结束后将凝胶取出，切胶，用考马斯亮蓝R-250 染液染色过夜。 脱色液脱色约1 h，倒入一半脱色液一半水脱色1 h，最后用凝胶成像仪的可见光成像系统成像。

1.3.5 组织蛋白酶L（CL）活力的测定 不同处理时间的海参体壁组织与提取液 （含有50 mmol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲溶液、0.1% Triton X-100 和1 mmol/L EDTA）按照1∶3（m∶v）的比例混合，冰浴研磨提取， 再于4 ℃，10 000 r/min 的条件下离心10 min，取上清液即为所需要的粗酶提酶液。

取待测样液50 μL， 加入25 μL 反应缓冲液（含60 mmol/L 乙酸、340 mmol/L 乙酸钠、4 mmol/L乙二胺四乙酸二钠、8 mmol/L DTT）和25 μL 20 μmol/L 底物（Z-Phe-Arg-Mec），混匀后37 ℃水浴15 min；设置空白对照组，取待测样液50 μL，加入100 μL 终止液（含0.1 mol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲液、0.1 mol/L 氯乙酸）和25 μL 20 μmol/L 底物，同样混匀后37 ℃水浴15 min； 最后样品组加入100 μL 终止液终止反应，空白对照组加入25 μL 反应缓冲液，采用荧光分光光度计测定酶活力，激发波长为380 nm，发射波长为460 nm。 以每毫克蛋白荧光值的差值比较组间CL 活力的变化。

1.3.6 Caspase-3 活力的测定 不同处理时间的海参体壁组织与裂解液 （含25 mmol/L pH 7.4 HEPES，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L DTT，1 μmol/L 胃蛋白酶抑制剂，1 mmol/L PMSF）1∶3 比例混合， 冰浴中研磨提取， 并在4 ℃、10 000 r/min 的条件下离心10 min，取得的上清液即为所需要的酶液。 在酶标板中加入10 μL 的待测酶液、80 μL 分析液 （含20 mmol/L pH 7.4 HEPES，1% CHAPS，50 mmol/L DTT 和5 mmol/L EDTA）和10 μL 底物（Ac-DEVD-PNA），设置3 个平行试验，并设置对照组加入90 μL 分析液和10 μL 样液， 然后测定405 nm处37 ℃条件下分别反应0 min 和30 min 的吸光值。

1.3.7 自由基测定 将低温处理后的海参直接冻干，制备冻干粉，然后将其填入石英样品管中，保证每个样品的填充量一致。 通过ESR 检测自由基生成情况， 具体检测条件如下： 微波功率6.10 mW，中心磁场3.460 G，转换时间480 msec，扫描宽度200 G，调制幅度1G，调制频率100 kHz，时间常数5 242.88 msec。

1.3.8 数据统计 试验数据以3 个平行组数据的平均值表示，并且计算标准差；用SPSS 软件对数据进行统计分析， 采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05 被认为是显著的。

2 结果与讨论

以海参、海参体壁为原料，其在20 ℃低温条件下处理不同时间：0，1/24，1/4，1/2，1，2，3，4，5，6 d，所产生品质和理化性质变化的结果如图1～图8所示。

2.1 低温处理条件下海参的形态变化

从图1 可以看出， 低温处理初期海参体型上有所增大，在处理1 d 时海参体壁开始鼓泡，组织开始拉伸并逐渐瘫软，表皮开始分解，随着在20℃低温条件下处理时间的延长， 海参的形态变化更加明显，开始软烂、变黏，直到完全失去其原有形态。

图1 海参在20 ℃处理条件下形态变化Fig.1 Morphological changes of sea cucumber under 20 ℃treatment conditions

2.2 低温处理条件下海参的胶原溶出情况

从图2 可以看出， 在低温条件下随着处理时间的延长，海参的可溶性胶原含量不断上升，在低温处理初期， 其上升趋势较为缓慢， 与对照组相比，升高不显著。从1/2 d 开始，其可溶性胶原含量呈显著上升趋势， 处理至6 d 时其可溶性胶原含量为对照组含量的3.23 倍。 该结果与2011年，Zhu 等人[10]发现的随着处理时间的延长鲍鱼肌肉的可溶性胶原含量呈上升趋势一致， 也与2015年，Starkey 等[11]发现的结果：随着羊羔老化时间的延长， 可溶性胶原含量呈增加的趋势相符。 2016年，王凤林等[12]研究发现在热处理过程中，随处理时间的延长和温度的升高， 海参体壁与罗非鱼皮胶原逐渐发生降解，海参体壁最终完全降解，而罗非鱼相对较稳定。

图2 海参在20 ℃处理条件下胶原溶出情况Fig.2 Collagen dissolution of sea cucumber under 20 ℃treatment conditions

2.3 低温处理条件下海参的质构变化

由图3 所示，随着低温处理时间的延长，海参的硬度和咀嚼度呈现出了一个先增大后减小的趋势。 海参硬度在1/4d 时达到最大值33 822.9 g±619g（P<0.05），随后随着处理时间的延长，海参硬度变化剧烈，呈显著下降趋势，在1～2 d 这段期间下降最为严重， 最终其硬度下降为0 d 时硬度的0.92%；在1/4 d 时海参咀嚼度达到最大值11 396.7 g±1 761 g（P<0.05），随着时间的延长，海参咀嚼度开始下降，而且在这个过程中，从1 d 开始其变化显著， 下降剧烈， 在1～2 d 这段期间下降最为严重， 在6 d 时其咀嚼度降为0 d 咀嚼度的0.22%。2016年，郑美静等[13]发现在超高压条件下海参的硬度和咀嚼度呈现相关性结果一致。 海参硬度与咀嚼度的下降可能与可溶性胶原含量有关。

图3 海参在20 ℃处理条件下质构变化Fig.3 Texture changes of sea cucumber under 20 ℃treatment conditions

2.4 低温处理条件下海参的蛋白降解情况

图4 海参在20 ℃处理条件下蛋白质降解情况Fig.4 Protein degradation of sea cucumber at 20 ℃treatment condition

从图4 可以清楚的看出200.0ku （高分子质量，HMW）和44.3 ku（肌动蛋白，actin）的两条蛋白条带。肌动蛋白是一种结构蛋白，它具有多种结合位点，能够和不同的蛋白质结合，完成多种细胞功能。 在高分子质量条带中，从1 d 开始，高分子开始降解，直到3 d 开始降解加剧。 而在肌动蛋白条带中，蛋白从1 d 时开始降解，直到3 d 时，肌动蛋白条带完全消失，说明在低温处理3d 后海参的结构几乎完全丧失， 从图1 海参的形态变化中也可看出。 这与2011年Christensen 等[14]发现鲱鱼和2012年Thavaroj 等[15]研究发现的鲶鱼和罗非鱼经长时间低温处理后其肌动蛋白会发生降解的结果相符。因此可以说明，海参长时间低温处理可能会引起蛋白降解。 2003年，Ladrat 等[16]经研究发现：随着鲈鱼存储时间的延长， 蛋白质的降解可能与组织蛋白酶L 的激活有关。

2.5 低温处理条件下海参的内源酶变化

海参低温处理初期组织蛋白酶-L 活力维持在较稳定的水平（图5a），随着低温处理时间的延长，1/4 d 时，组织蛋白酶-L 被激活，并在1/2 d 时其活性达到最大值（2 352.3±296.4）U/mg 蛋白（P<0.05），随后组织蛋白酶-L 活力显著下降，直到第4 天时组织蛋白酶-L 失活，失去其原有活力，活力值较对照组比下降约一倍。由图4 可看出，蛋白质在1d 时开始降解，而且这个过程是持续且不断加剧的，而在这之前，组织蛋白酶-L 已经被激活，说明组织蛋白酶-L 的激活可能会对蛋白质的降解产生影响。 3 d 后，蛋白降解程度与组织蛋白酶-L活力呈负相关。 这与2014年Ge 等[17]报道的组织蛋白酶-L 会间接影响蛋白降解的结果相一致；caspase-3 的活力在1/2 d 之前没有发生显著变化（图5b），说明在前期时其酶活性未被激活，而到1/2 d 时， 其相对活力显著增强，caspase-3 活性被激活，1 d 时其相对活力达到最大值 （3.1139 ±0.2173）U/mg 蛋白（P<0.05），随后呈下降趋势，2 d 时较最高活力下降约1/2，3d 后其活力仅为最高活力的26.43%， 与对照组相比活力也下降了，并一直维持在相对稳定的水平，说明caspase-3 活力从3 d 开始已经失活。 其结果与2009年Kemp等[18]在羊肌肉中以及2013年Cao 等[19]在牛骨骼肌中发现的结果相一致。Caspase-3 属于细胞凋亡中的执行因子，有报道显示，凋亡诱导分子会对组织蛋白酶-L 发生作用，进而导致凋亡激活因子的释放， 从而激活下游caspase 对于蛋白质的降解，进而导致组织损伤[20]。 这说明了caspase-3 的激活会影响蛋白质降解。

图5 海参在20 ℃处理条件下内源酶变化Fig.5 Changes of endogenous enzymes in sea cucumber under 20 ℃treatment comdition

2.6 低温处理条件下海参自由基信号强度变化

图6 海参在20℃处理条件下自由基信号强度变化Fig.6 Variation of free radical signal intensity at 20 ℃treatment condition

由图6 可以看出，信号强度在1/4 d 之前是趋于稳定的，变化并不显著，而随着低温处理时间的延长，自由基被激活，开始发生作用，信号强度明显增强， 并在1/2 d 时达到最大值1.27±0.08（×105），随后信号强度逐渐降低，从3 d 开始信号明显减弱，4～6 d 未检测到明显的自由基信号峰（数据未显示）。 低温处理可能会造成自由基的产生，蛋白质的种类繁多且大多数都分布在细胞内外，极其容易受到氧自由基的攻击， 因此自由基信号的增强可能会导致蛋白质的降解。 据2010年Acharya 等[21]研究发现低浓度的ROS 能够通过调节体内的平衡以及细胞内的信号来体现其有益作用；但是高水平的ROS 会对蛋白质、脂质和DNA造成损伤，并在其中起主要的作用。 由此可知，海参低温处理过程中自由基的产生对海参品质变化起重要作用。

3 结论

随着低温处理时间的延长， 海参质构和理化性质发生改变，其中包括形态变化、质构变化（咀嚼度和硬度）和内源酶活化、胶原溶出、蛋白降解。海参的品质变化与组织蛋白酶L、Caspase-3 的活力，结构蛋白质的降解，自由基的生成有一定程度的联系， 其中海参在1/2 d 左右时硬度相对较小，内源酶活力相对较高，形态也未发生明显的变化，嫩度相对较好。而随着低温处理时间的延长，内源酶的激活使蛋白质不断发生降解，胶原溶出增加，进而造成海参的硬度和咀嚼度下降， 嫩度发生不良变化，海参品质下降。下一步我们可以通过控制海参内源的理化指标变化，改变海参的加工品质，以获得品质上呈的加工产品。