miR-23b-3p靶向XIAP调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的机制研究*

蔡松涛， 孙京涛， 魏 瑄

(郑州市骨科医院关节病二科， 河南 郑州 450052)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种由于自身免疫调节功能紊乱而造成的慢性关节疾病，患者关节处滑膜细胞出现异常增殖，这种与肿瘤细胞类似的侵蚀性生长会对软骨组织造成极为的严重破坏，进而导致患者关节关节疼痛、畸形以及关节的活动受到限制[1-2]。总体来说，RA受外界环境和个人体质以及生活习惯的影响，然而RA的具体发病机制尚不清楚。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度约为22 nt,广泛存在于真核生物中保守的非编码RNA，可特异性作用于下游靶基因的3’-UTR区，降解下游靶基因的mRNA或者阻止靶基因的蛋白翻译过程，从而发挥对靶基因的负调节机制。研究表明，miRNA可将信号通路中的关键蛋白作为开关，通过调控靶基因的活性来影响信号通路的传递，从而影响细胞增殖代谢进程[3-4]。miRNA表达水平的异常往往与自身免疫性疾病相关联，在RA患者中多种miRNA表达存在异常，miR-155、miR-499和miR-146a等显著上调[5-6]，而miR-22、miR-124a、miR-23b和miR-34a等显著下调[7-10]。由此可见，miRNA在RA的病变过程中发挥着重要作用。通过TargetScan分析可知，RA滑膜成纤维细胞中低表达的miR-23b-3p与X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)具有靶向关系，本研究将设计实验验证miR-23b-3p对XIAP的靶向关系并探究其可能的具体调控机制，以期为RA新的靶点治疗提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 实验材料

人正常关节滑膜成纤维细胞及类风湿关节炎滑膜成纤维细胞购自上海赛百慷公司。胎牛血清、DMEM高糖培养液和胰蛋白酶Ⅰ购自Gibco；抗GAPDH、Ki67和Bcl-2抗体以及Ⅱ抗购自Cell Signaling Technology；双萤光素酶报告基因试剂盒购自Biotium；miR-23b-3p模拟物和抑制物购自上海吉玛公司；TRIzol、反转录试剂盒和Lipofectamine 2000试剂盒购自Introvigen；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix购自Thermo；合成其余分子试剂购于上海生工生物工程公司；流式细胞仪购自Bio-Rad；实时荧光定量PCR仪购自Roche；引物由北京华大基因公司提供。

2 方法

2.1细胞的培养 从液氮中取出细胞置于37 ℃水浴锅中，待其融化后转入含有DMEM培养液的离心管中，1 500×g离心5 min后去除上清，少量培养液重悬后转入含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37 ℃、5%CO2和95%相对湿度条件下静置培养。

2.2双萤光素酶报告基因实验 设计并合成含有miR-23b-3p结合位点的XIAP 3’-UTR正常片段及其突变体，将其插入pMIR-REPORT载体的报告基因下游区域，获得含有XIAP的WT-3’-UTR和Mut-3’-UTR的重组质粒。使用Lipofectamine 2000将miR-23b-3p模拟物与XIAP的WT-3’-UTR或Mut-3’-UTR重组质粒共转染，48 h后使用双萤光素酶报告基因试剂盒检测萤光素酶相对活性，具体参照说明书。

2.3细胞的转染 取状态良好的对数生长期细胞，按照5×104浓度接种于无菌细胞培养板中，待细胞的融合度生长至75%～85%，使用0.5%胰蛋白酶消化后，按照Lipofectamine 2000说明书分别将miR-23b-3p模拟物、miR-23b-3p抑制物和miRNA对照(negative control, NC)组转染至细胞中。

2.4RT-qPCR分析miR-23b-3p和XIAP mRNA的表达水平 取转染48 h后的3组细胞常规培养，当细胞覆盖率80%时，收集细胞，使用TRIzol提取细胞中的RNA，电泳检测质量，反转录为cDNA，具体操作参考说明书。实验以U6和GAPDH为内参照，计算公式为2-ΔΔCt，每组3个重复。U6的上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； miR-23b-3p的上游引物序列为5’-CGCATCACATTGCCAGGG-3’,下游引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。GAPDH上游引物为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；XIAP上游引物5’-AATTGGGAACCTTGTGATCG-3’,下游引物为5’-AGAAAGTGTCGCCTGTGTT-3’。反应体系为20 μL，具体参考说明书。

2.5CCK-8检测细胞的活力 调整转染成功的3组细胞浓度为2×108/L，每孔100 μL接种至96孔板中，在37 ℃条件下继续培养24、48、72和96 h后，避光添加100 μL CCK-8溶液，使用酶标仪检测A450值，绘制细胞活力随时间变化的曲线，每组3个重复。

2.6流式细胞术检测细胞凋亡 离心收集成功转染miR-23b-3p模拟物、抑制物和对照miRNA的3组细胞，PBS缓冲液重悬细胞后，避光条件下加入含有propidium iodide (PI)和Annexin V-FITC的溶液，孵育20 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每组3个重复。

2.7Western blot分析 收集成功转染3组细胞，RIPA裂解提取细胞内总蛋白，离心收集上清液，BCA法进行蛋白定量。每组细胞取60 μg蛋白做SDS-PAGE，结束后转移蛋白至PVDF膜上。之后，使用BCA低温封闭过夜，TBST洗膜5次，加入Ⅰ抗摇晃孵育2 h，TBST再次洗膜5次，加入Ⅱ抗摇晃孵育1 h，TBST最后洗膜5次。将膜取出在暗室中进行曝光成像，并对表达量进行分析。

3 统计学分析

数据分析采用SPSS 20.0软件，计量结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组和多组间比较分别采用t检验和单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-23b-3p和XIAP mRNA的表达水平

RT-qPCR结果显示，正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的miR-23b-3p相对表达水平分别为1.00±0.03和0.42±0.05，XIAP mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和1.56±0.11。与正常关节滑膜成纤维细胞相比，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的miR-23b-3p表达显著下调(P<0.05),XIAP的mRNA表达显著上调(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression level of miR-23b-3p and XIAP mRNA in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1 类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中miR-23b-3p和XIAP mRNA表达水平

2 XIAP是miR-23b-3p的潜在靶标

TargetScan数据库预测结果显示,XIAP的3’-UTR中含有与miR-23b-3p种子区互补序列,见图2A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，与XIAP-3’-UTR-WT NC组相比，miR-23b-3p模拟物与XIAP-3’-UTR-WT共转染使萤光素酶活性显著降低(P<0.05)，而miR-23b-3p模拟物与XIAP-3’-UTR-Mut共转染后萤光素酶的活性无显著变化(P>0.05)，见图2B。

Figure 2.Verification of targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP. A: the targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP was predicted by TargetScan; B: dual-luciferase reporter assay was used to confirm the targeting relationship. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs3′-UTR-WT NC group.

图2 miR-23b-3p与XIAP靶向关系验证

3 miR-23b-3p抑制XIAP的表达

与对照组相比，miR-23b-3p模拟物显著提高miR-23b-3p表达水平，减少XIAP表达水平；miR-23b-3p抑制物则使miR-23b-3p表达下调，XIAP表达上调，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

4 miR-23b-3p对细胞活力具有抑制作用

CCK-8法结果显示，与对照组相比，miR-23b-3p模拟物对细胞的活力出现了抑制现象，miR-23b-3p抑制剂促进了细胞活力，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

5 miR-23b-3p对细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，与对照组相比，miR-23b-3p抑制物组凋亡率显著减少，而miR-23b-3p模拟物则促进了细胞的凋亡(P<0.05),见图5。

Figure 3.The expression of XIAP mRNA and miR-23b-3p detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

图3 miR-23b-3p模拟物和抑制物对miR-23b-3p和XIAP mRNA表达水平的影响

Figure 4.The effect of miR-23b-3p on the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

图4 miR-23b-3p对细胞活力的影响

6 miR-23b-3p对增殖和凋亡相关蛋白的影响

Western blot检测miR-23b-3p抑制物组、模拟物和对照组胞内增殖相关蛋白Ki67以及凋亡相关蛋白Bcl-2表达量，结果显示，3组细胞内的Ki67蛋白表达量分别为：miR-23b-3p抑制物组1.14±0.20，对照组0.81±0.03，miR-23b-3p模拟物组0.35±0.02；Bcl-2蛋白表达量分别为：miR-23b-3p抑制物组2.27±0.20，对照组1.02±0.04，miR-23b-3p模拟物组0.76±0.04，整体比较差异均具有统计学意义(FKi67=34.308，PKi67<0.05；FBcl-2=135.771，PBcl-2<0.05),见图6。

Figure 5.The effect of miR-23b-3p on apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

图5 miR-23b-3p对细胞凋亡的影响

Figure 6.The protein expression levels of Ki67 and Bcl-2 were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

图6 Western blot检测Ki67和Bcl-2蛋白表达水平

讨 论

RA是一种表现为滑膜细胞异常增殖的自身免疫性疾病，其滑膜细胞组织结构可增生至8层以上，远远大于正常滑膜组织的1～2层的细胞层，这种过度异常增殖的滑膜最终将向关节处的软骨组织侵袭性生长，导致关节畸形，造成关节活动受限[11-12]。其中，在RA中起着重要作用的滑膜细胞即为类风湿关节炎滑膜成纤维细胞，在RA患者滑液中含有多种细胞促炎因子及抗凋亡因子，使滑膜组织细胞的增殖与凋亡速度失衡，从而出现异常增殖的现象[13-15]。在RA出现多种miRNA上调或下调，包括显著上调的miR-155，其被证实参与了细胞的多种炎症反应，能够抑制MMP-3来减缓组织炎症损伤和增强组织中CD14+细胞的抗凋亡能力[6,16-17]；低表达的miR-124a与增殖相关蛋白CDK2以及MCP-1具有靶向关系，其下调表达促进了RA的发生进程[9]。除此之外，miR-23b是一种具有抗炎作用的保护性miRNA，在RA滑膜成纤维细胞中表达同样显著下调，并且其介导的TGF-β、IκB激酶、TAB2和细胞因子的表达受IL-7炎症因子的负调控[10, 18-19]。为探讨miR-23b-3p在RA的作用机制，本研究通过RT-qPCR检测miR-23b-3p在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的表达情况。结果显示，miR-23b-3p在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达水平是正常细胞的一半左右，显著下调表达，与文献[10]报道一致。

XIAP是IAP家族中的重要一员，可直接通过与caspase类蛋白作用而抑制其功能，是细胞中一种不可或缺的凋亡抑制因子[20]。多种疾病均伴随着XIAP的失调表达，其中XIAP的丢失会增强细胞的敏感性，XIAP上调表达能增强细胞的抗辐射能力并且可能与肿瘤有着重要联系[21-24]。除此之外，有研究表明XIAP能够依赖自身的抗凋亡能力对细胞的自噬途径产生重要影响[25]。同时，XIAP在肿瘤中受到多种miRNA的调控，与细胞的生物学活动有着重要联系[21, 26-28]。在本研究，TargeScan软件分析显示，XIAP的3’UTR含有miR-23b-3p种子互补区的保守序列，是miR-23b-3p的一个潜在靶基因。本研究将miR-23b-3p模拟物与XIAP-3’-UTR-WT共转染细胞后，萤光素酶活性显著降低，证实了两者之间的靶向关系。为进一步探讨两者之间的具体调控机制，将miR-23b-3p的模拟物和抑制物转染到细胞中，结果显示转染miR-23b-3p模拟物和抑制物后，XIAP mRNA分别显著下调5倍和上调表达2倍左右，表明XIAP受miR-23b-3p的负向调控。此外，本研究表明转染miR-23b-3p能够抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖并促进其发生凋亡，转染抑制物的效果与之相反。此时，细胞内增殖相关蛋白Ki67和抗凋亡相关蛋白Bcl-2与miR-23b-3p表达量负相关，上调miR-23b-3p促使Ki67和Bcl-2下调表达，敲低miR-23b-3p则促进促使Ki67和Bcl-2表达上调。以上结果表明，miR-23b-3p可通过靶向XIAP抑制细胞增殖促进凋亡在类风湿关节炎中发挥保护作用。本研究虽探讨了miR-23b-3p对XIAP的调控机制，但是文献中提到的miR-23b-3p的抗炎作用和本研究证实的促凋亡保护机制之间的协同性仍需进一步研究。

综上所述，miR-23b与RA有着紧密联系，可通过靶向XIAP抑制RA滑膜成纤维细胞增殖，促进其凋亡。