褐藻糖胶对大鼠肠缺血再灌注损伤的作用及潜在机制*

刘雪环， 胡沙沙， 王 程， 栾 晓， 郭菲菲， 孙向荣， 徐 珞△

(1青岛大学基础医学院生理与病理生理学系， 山东 青岛 266021； 2青岛大学附属医院病理科， 山东 青岛 266555)

肠缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤是创伤、严重感染及休克等疾病共同存在的病理生理过程，其不仅引起肠屏障功能障碍，还可导致远端器官损伤、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1]。目前关于肠I/R损伤的确切机制尚未完全阐明，但活性氧(reactive oxygen species, ROS)和炎症因子的产生被认为是导致肠I/R损伤的重要机制。褐藻糖胶(fucoidan)是一种从海带中提取纯化的天然复合多糖，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎和免疫调节等多种生物学活性[2]。研究表明，褐藻糖胶可改变肠道菌群，减轻环磷酰胺引起的肠黏膜损伤[3]，且褐藻糖胶对心肌、肾、肝以及脑缺血再灌注损伤具有脏器保护作用[4-7],但褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤是否具有肠保护作用尚不清楚。因此，本研究在构建大鼠肠缺血再灌注损伤模型基础上，初步探讨了褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤的影响及潜在机制，为开发褐藻糖胶用于临床缺血再灌注损伤性疾病的治疗提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 实验试剂

褐藻糖胶，纯度99%，购自Sigma；二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和D-乳酸(D-lactic acid, D-LA)ELISA试剂盒购自武汉优尔生科技股份公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)试剂盒购自南京建成生物工程公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)和白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)ELISA试剂盒均购自欣博盛生物科技公司;抗Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2及β-actin抗体均购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1实验分组及肠缺血再灌注模型的构建 30只(SPF级，8周龄)成年雄性Wistar大鼠(购于山东省青岛市药品检验所)，体重250～300 g，随机分为3组(n=10)：假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组和褐藻糖胶(Fucoidan+I/R)组。Fucoidan+I/R组于缺血再灌注前7 d持续腹腔注射浓度为20 g/L的褐藻糖胶(160 mg/kg)[7]直至处死；sham组及I/R组大鼠腹腔注射等量的生理盐水作为对照。所有大鼠术前禁食(可自由饮水)12 h，称重，10%水合氯醛(30 mL/kg)腹腔麻醉。将大鼠仰卧固定于鼠板，剑突下腹正中做长约3 cm切口，暴露肠系膜上动脉。Sham组仅分离肠系膜上动脉，并不夹闭。分离肠系膜上动脉后，I/R组和Fucoidan+I/R组均用无创血管夹夹闭肠系膜上动脉1 h，松夹后，持续再灌注2 h，制备肠缺血再灌注模型。

2.2样本的采集

2.2.1血标本 实验结束后，大鼠经腹主动脉取血4 mL，室温静置30 min，离心(4 ℃，1 000×g)10 min，取上层血清，-80 ℃冰箱保存，以备DAO、D-LA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平检测。

2.2.2组织标本 取距盲肠约5 cm的回肠组织5～6 cm，迅速放入备好的冰生理盐水进行漂洗，无菌滤纸吸干水分。剪下1～2 cm肠段放入4%甲醛溶液固定后用石蜡包埋，用于后续小肠组织形态观察。另剪下1～2 cm肠段刮取肠上皮黏膜，制备10%组织匀浆，离心(4 ℃，1 000×g)10 min，吸取上清液，存于-80 ℃冰箱，用于组织MDA和GSH含量及SOD和MPO活性的检测。剩余肠段，存于-80 ℃冰箱，用于组织Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白水平的检测。

2.3肠黏膜形态学观察 回肠组织常规石蜡包埋，制作厚约5 μm切片，常规HE染色，光镜下观察小肠黏膜形态结构的变化，并采用Chiu’s 6级评分法对肠黏膜损伤程度进行评价[8]。0分：正常小肠绒毛上皮；1分：绒毛尖端处上皮下间隙增大，毛细血管有淤血现象；2分：上皮下间隙扩张，伴随上皮层同固有层的中度分离；3分：绒毛两侧上皮层大量地同固有层分离，部分绒毛顶端破损；4分：绒毛破损伴随固有层毛细血管暴露，固有层中性粒细胞增多；5分：固有层破坏、内皮下出血和溃疡。

2.4血清DAO、D-LA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平测定 采用酶联免疫吸附测定法检测血清DAO、D-LA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平，所有指标的检测应严格按照ELISA说明书进行操作。

2.5肠组织MDA、GSH含量和SOD、MPO活性测定 采用硫代巴比妥酸法测定肠组织MDA的含量；采用二硫代双硝基苯甲酸比色法测定肠组织GSH的含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定肠组织SOD活性；采用依赖过氧化氢的邻联二茵香胺氧化还原反应法测定肠组织MPO的活性。所有指标的检测严格遵守试剂盒说明书指引。

2.6Western blot法检测肠组织Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白的水平 取冻存回肠组织，剪碎，加入裂解液冰上30 min，离心(4 ℃，16 000×g)5 min，提取上清液并蛋白定量。进行SDS-PACE分离蛋白，转膜，然后加入封闭液室温孵育1 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min,加Ⅱ抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，化学发光法显色，运用ImageJ图像分析系统对每个条带进行灰度分析。

3 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜形态学变化的影响

光镜下可见，sham组大鼠肠黏膜组织绒毛排列整齐，未见有明显损伤；但I/R组肠黏膜组织结构紊乱，绒毛组织发生严重脱落并伴有腺体的严重受损；而Fucoidan+I/R组肠黏膜组织损伤较轻，绒毛呈轻中度水肿，绒毛顶端变钝，表面的杯状细胞清晰可见，偶见崩解，见图1A。Chiu’s评分结果显示，与sham组相比，I/R组肠黏膜组织损伤明显加重(P<0.05)；与I/R组相比，Fucoidan+I/R组大鼠肠黏膜组织损伤显著减轻(P<0.05)，见图1B。

Figure 1.HE staining was used to observe the effect of intraperitoneal injection of fucoidan on the morphology of intestinal mucosa in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. A: histopathological pictures; B: Chiu’s score. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

图1 HE染色观察腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜形态学变化的影响

2 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠血清DAO和D-LA水平的影响

与sham组相比，I/R组血清DAO和D-LA水平显著升高(P<0.05)，而褐藻糖胶预处理能显著降低肠缺血再灌后血清DAO和D-LA水平，但仍高于sham组(P<0.05)，见表1。

3 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜MDA、GSH含量和SOD活性的影响

与sham相比，I/R组大鼠肠黏膜组织中MDA含量显着增加(P<0.05)；与I/R组相比，褐藻糖胶预处理可显著降低肠黏膜中MDA含量(P<0.05)，但仍高于sham组(P<0.05)。与sham组相比，I/R组及Fucoidan+I/R组肠组织GSH含量和SOD活性均显著降低(P<0.05)，但Fucoidan+I/R组肠组织GSH含量和SOD活性显著高于I/R组(P<0.05)，见图2。

表1 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠血清DAO和D-LA水平的影响

Table 1.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on serum DAO and D-LA levels in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury (Mean±SD.n=10)

GroupDAO (103 U/L)D-LA (mg/L)Sham1.43±0.170.57±0.09I/R4.59±0.41∗2.46±0.25∗Fucoidan+I/R2.58±0.43∗#1.36±0.12∗#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

Figure 2.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on MDA, GSH content and SOD activity in intestinal mucosa of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

图2 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜MDA和GSH含量及SOD活性的影响

4 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜组织MPO活性的影响

MPO作为中性粒细胞浸润的指标，其检测结果显示，与sham组相比，I/R组大鼠肠黏膜组织MPO活性显着增加(P<0.05)；与I/R组相比,褐藻糖胶预处理能显著降低肠黏膜组织MPO活性(P<0.05)，但仍显著高于sham组(P<0.05)，见图3。

5 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响

与sham组相比，I/R组的炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显升高(P<0.05)，褐藻糖胶预处理能显著抑制I/R诱导的血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的升高(P<0.05)，但仍高于sham组(P<0.05)，见表2。

Figure 3.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on MPO activity in intestinal mucosa of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

图3 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜组织MPO活性的影响

表2 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平的影响

Table 2.The effect of intraperitoneal injection of fucoidan on serum levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury (ng/L. Mean±SD.n=10)

GroupTNF-αIL-6IL-1βSham10.65±1.608.72±1.495.04±0.41I/R55.77±4.36∗49.14±2.99∗38.70±2.87∗Fucoidan+I/R29.81±2.33∗#21.75±2.08∗#16.01±1.34∗#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

6 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠组织Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达的影响

与sham组相比，I/R组的Bax和cleaved caspase-3蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白的表达显著降低(P<0.05)，褐藻糖胶预处理能明显降低缺血再灌注后肠组织Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达，升高Bcl-2蛋白的表达(P<0.05)，但Bax和cleaved caspase-3蛋白表达仍高于sham组，Bcl-2蛋白表达仍低于sham组(P<0.05)，见图4。

讨 论

肠缺血再灌注损伤是临床过程中的常见事件，常继发于肠绞窄、小肠移植和肠系膜血管缺血性疾病。I/R诱导的肠黏膜损伤，可使肠黏膜通透性增加，继而引发内毒素血症、肠内细菌移位和大量炎症因子的释放，随之可诱导全身炎症反应综合症和多器官功能障碍综合征的发生。此外，氧自由基生成及脂质过氧化反应增强也是引起肠缺血再灌注损伤的重要病理生理机制[9]。

Figure 4.Effects of intraperitoneal injection of fucoidan on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

图4 腹腔注射褐藻糖胶对肠缺血再灌注损伤大鼠肠组织Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达的影响

DAO是具有高度活性的细胞内酶，D-LA是肠道内固有细菌代谢的产物之一，其活性变化可以反映肠黏膜通透性强弱，进而显示出肠屏障损伤程度[10]。有文献报道，褐藻糖胶可减轻氧化应激诱导的肠道上皮细胞屏障损伤[11]，最新研究显示，在乳腺癌大鼠模型中，褐藻糖胶可通过促进TJ蛋白的表达，增强肠屏障功能[3]。本实验结果显示，与假手术组相比，I/R组大鼠血清DAO和D-LA水平明显升高，而Fucoidan+I/R组大鼠血清DAO及D-LA水平与I/R组相比显著降低。此外，与I/R组相比，Fucoidan+I/R组大鼠肠黏膜组织损伤显著减轻，Chiu’s评分降低，提示褐藻糖胶可能具有肠黏膜细胞保护作用，这可能与减弱肠黏膜通透性相关。

肠缺血再灌注后大量氧自由基的释放是导致肠缺血再灌注损伤的重要因素之一。MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量与自由基引起的细胞损伤程度呈正比[12-13]。GSH和SOD均为清除氧自由基的重要酶，其水平的高低反映了机体清除氧自由基的能力。 研究显示，褐藻糖胶可抑制肝I/R损伤诱导的肝组织MDA水平[6]，褐藻糖胶可纠正脑I/R损伤诱导的MDA和SOD异常水平[7]。本研究观察到，与I/R组相比，Fucoidan+I/R组大鼠肠黏膜组织MDA含量显著降低，但GSH含量及SOD活性显著升高，提示褐藻糖胶能有效抑制肠缺血再灌注损伤后氧化应激反应，在肠缺血再灌注损伤中发挥着潜在抗氧化作用。

MPO是嗜中性粒细胞颗粒的特征成分，可反映中性粒细胞浸润和激活的程度，进而反映炎症损伤程度[14]。文献报道，在心脏和肾缺血再灌注损伤中，褐藻糖胶能显著抑制心脏和肾脏的MPO活性，还可抑制炎症细胞浸润、白细胞滚动和白细胞迁移[5]。本研究结果显示，褐藻糖胶预处理的肠缺血再灌注大鼠，其肠组织MPO活性显著降低，提示褐藻糖胶可能通过抗炎作用减轻肠组织缺血再灌注损伤。

炎性细胞因子的大量产生是肠缺血再灌注损伤发展的重要病理机制，TNF-α、IL-6和IL-1β是重要的促炎细胞因子，被认为是人体细胞炎症反应的分子标志物[15]。近期研究表明[16]，在肠道炎症时，低分子量的褐藻糖胶可通过抑制IL-1β和TNF-α的产生增强肠黏膜屏障。有文献报道[17]，低分子量的褐藻糖胶可抑制脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的活性。本研究结果显示，I/R组大鼠血清TNF-α、IL-6以及IL-1β的水平显著升高；褐藻糖胶预处理，可显著降低I/R损伤大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，提示在肠缺血再灌注损伤中，褐藻糖胶可能通过抗炎效应发挥肠黏膜细胞保护作用。

细胞凋亡途径分外源性(死亡受体)、内源性(线粒体)和内质网凋亡3个途径。抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax是细胞内源性线粒体通路的重要调节因子；caspase-3是凋亡途径中重要的凋亡执行因子，其水平的高低可反映细胞凋亡的程度[18]。细胞凋亡是缺血再灌注损伤引起小肠绒毛上皮细胞死亡的主要形式[19]。Gao等[20]研究显示，褐藻糖胶可通过降低Bax/Bcl-2比率或降低caspase-3表达，进而抑制过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡。本研究表明，与缺血再灌注组相比，褐藻糖胶组大鼠肠组织中Bcl-2蛋白表达显著升高，Bax及cleaved caspase-3蛋白表达则显著表达降低，提示褐藻糖胶在肠缺血再灌注损伤中具有抗细胞凋亡的作用。

综上所述，褐藻糖胶可减轻肠缺血再灌注诱导的小肠组织损伤，其机制可能与减少中性粒细胞浸润、炎症因子释放，降低脂质过氧化反应、增强抗氧化酶活性以及抑制细胞凋亡有关。