人参皂苷Rb1对高脂血症大鼠肝脏细胞焦亡的影响及其可能机制*

于 宁， 宋 囡， 贾连群△， 陈 宁， 陈 丝， 吴 瑶， 杨关林△

(辽宁中医药大学 1研究生学院， 2重大科研平台中医脏象理论及应用教育部重点实验室， 3心脑合病中西医结合防治技术国家地方联合工程实验室， 辽宁 沈阳 110847)

血脂异常是临床上多发和常见的脂肪代谢及转运异常性疾病[1-2]。血脂异常不仅仅是动脉粥样硬化、糖尿病和肥胖的原因，同时也是引起慢性肝损伤的重要因素。长期的高脂饮食可导致肝细胞脂肪变性，并伴随着炎症的发生[3-4]。近年研究发现，细胞焦亡(pyroptosis)是继细胞凋亡和细胞坏死后发现的一种新的细胞程序性、炎性死亡方式，广泛存在于慢性肝脏疾病发生过程中，抑制肝脏细胞焦亡的发生可以降低肝损伤时肝细胞的损伤程度，减少炎症因子的生成,抑制炎症反应[5-6]。

人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)是人参的主要有效成分之一，具有改善肝脏脂肪变性、降低血脂、抑制肝脏炎症反应及抗肝损伤等作用[7-10]，但其具体机制尚未完全阐明。既然人参皂苷具有抑制肝脏炎症反应的作用，而与炎症相关的程序性细胞死亡方式——细胞焦亡存在于肝脏疾病中，那么人参皂苷抑制肝脏炎症反应的作用机制有可能是通过抑制肝脏细胞焦亡实现的。因此，本研究构建高脂血症大鼠模型，以细胞焦亡为切入点，探讨人参皂苷Rb1对高脂血症大鼠肝脏脂质沉积的影响及作用机制，为中医中药在临床中的应用提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 主要药品、试剂及仪器

人参皂苷Rb1购自西安天丰生物科技有限公司；抗NLRP3抗体、抗白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗体和抗白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)抗体购自博奥森公司(批号分别为bs-23723R、bs-20448R和bs-0529R)；抗胱天蛋白酶1(caspase-1)抗体和抗gasdermin D(GSDMD)抗体购自AVIVA SYSTEMS BIOLOGY(批号分别为ARP58983-P050和OACA03071)；抗GAPDH抗体购自Abbkine(批号#A01020)；BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪(批号CW0014S)；苏木精-伊红(HE)染色液购自碧云天生物技术有限公司(批号C0105)；油红O购自Sigma;所用PCR 引物由Primer Premier 5.0软件设计，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。7500 Real-time PCR仪购自Applied Biosystems；TAB-120FR 型全自动生化分析仪购自日本东芝公司；全能型快速转印系统购自BIO-RAD。

2 动物

SPF级SD大鼠32只，体重(190±20) g，由辽宁长生生物科技股份有限公司提供，动物合格证号SCXK(辽)2015-0001。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，实验单位许可证号SYXK(辽)2013-0009，室内温度18～22 ℃，湿度40%～70%，单笼饲养，每天12/12 h昼夜明暗交替。动物实验符合辽宁中医药大学实验动物伦理委员会标准，实验动物伦理审查编号21006092017056。

3 实验方法

3.1模型制备、分组及给药方式 32只SPF级健康 SD大鼠适应性喂养2周后，随机分为正常(control)组、模型(model)组、人参皂苷Rb1(Rb1)组和辛伐他汀(simvastatin)组。正常组每日给予基础饲料，模型组、人参皂苷Rb1组和辛伐他汀组每日给予高脂饲料(10%猪油，1%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%甲基硫氧嘧啶，5%蔗糖，加83.3%普通饲料)，自由摄食，饮水不限。4周后，模型组、人参皂苷Rb1组和辛伐他汀组继续高脂饲料喂饲，同时灌胃给药，给药剂量按人和动物体表面积折算系数换算，人参皂苷Rb1组给予200 mg·kg-1·d-1，辛伐他汀组给予2.1 mg·kg-1·d-1，对照组与模型组则每日给予等体积的生理盐水。给药8周后，检测血脂，并取整个肝组织。

3.2血脂检测 取材前12 h禁食不禁水，实验当天称体重，10%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血装于抗凝试管中，室温静置30 min后，3 500 r/min 离心25 min，取血清分装，-20 ℃保存待用。全自动生物化学分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C) 含量。

3.3肝脏组织病理学观察 取大鼠肝脏组织，4%多聚甲醛固定72 h，按苏木素-伊红(HE) 染色常规方法进行，70%～100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(切片厚度 5 μm)、贴片、烤片后，用二甲苯脱蜡,70%～100%梯度乙醇复水,苏木精染色,70%盐酸乙醇分色,伊红复染，再用 70%～100%梯度乙醇脱水,二甲苯透明，中性树胶封片，石蜡包埋，光学显微镜下观察。

3.4Western blot法检测细胞焦亡相关蛋白的表达 取0.1 g肝脏组织，加入1 mL裂解液，在冰上充分研磨，吸入到1.5 mL的无菌EP管中,冰上静置30 min，12 000 r/min、 4 ℃离心10 min，取上清。利用BCA蛋白定量测定试剂盒对蛋白进行定量。取样品蛋白和2×蛋白缓冲液各100 μL于1.5 mL EP管中，100 ℃加热5 min变性。以60 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE分离后，2.5 A、25 V半干转7 min，转移至PVDF膜，丽春红染色后脱色，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，对照marker，把膜上的目的蛋白剪开，加入I抗4 ℃过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，加入II抗。孵化1 h,TBST洗涤3次,每次10 min,配制ECL发光液,曝光，保存条带，灰度值分析，以GAPDH为内参照，对蛋白条带进行相对定量分析。

3.5RT-qPCR法检测细胞焦亡因子mRNA的表达 TRIzol 裂解肝脏组织，提取总RNA，吸光度测定方法检测RNA浓度和纯度。RNA纯度A260/A280应在1.8～2.2 范围内。基因组DNA去除体系: 5 μL 200 μg/L total RNA，1 μL 10×gDNA Eraser Buffer，0.5 μL gDNA Eraser，3.5 μL RNase-Free Water。PCR仪反应条件: 42 ℃ 2 min。逆转录成cDNA，反应体系: 10 μL去除基因组 DNA 的总RNA，1 μL HiFi Script (2×108U/L)，1 μL Primer Mix，4 μL 5×Script RT Buffer，4 μL RNase-Free Water。PCR仪反应条件为: 42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。PCR扩增反应体系:2 μL DNA模板，25 μL 2×(Low Rox),1 μL上游引物，1 μL下游引物，21 μL ddH2O。PCR条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。用SYBR Green Mater Mix试剂检测 mRNA水平，重复3次。用2-ΔΔCt法对RT-qPCR 结果进行定量分析。ΔCt值为目的mRNA Ct值与内参照mRNA Ct值的差值,ΔΔCt为各实验组ΔCt与空白对照组ΔCt的差值。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR的相关引物序列

F: forward; R: reverse.

4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组之间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 人参皂苷Rb1对各组大鼠血脂水平的影响

与control组比较，model组大鼠血清TC、TG和LDL-C含量显著升高(P<0.01)，HDL-C含量显著下降(P<0.05)；与model组比较，Rb1组和simvastatin组大鼠血清TG含量显著下降(P<0.01)，TC和LDL-C 含量均下降(P<0.05)，HDL-C显著升高(P<0.01)，Rb1组与simvastatin组比较无统计学意义，见表2。

表2 各组大鼠血清血脂水平比较

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group.

2 人参皂苷Rb1对高脂血症大鼠肝组织形态学影响

Control组肝小叶结构正常，肝细胞呈条索状排列，肝窦正常不狭窄，肝细胞圆形，核圆居中，胞浆内未见脂滴; model组肝细胞体积增大，肝细胞浆内可见大量脂肪滴，脂滴大小不等，脂肪变性的细胞布满视野，肝窦狭窄或消失；simvastatin组的病变程度较model组明显减轻，可见少量脂肪滴，肝细胞肿胀较模型组轻，可见到正常的肝细胞，肝窦狭窄有所恢复；Rb1组病变恢复程度与simvastatin相似，肝细胞结构有所恢复，脂肪变性程度较model组减轻，可见少量脂肪空泡，肝窦狭窄有所恢复,见图1。

Figure 1.Morphological characteristics of liver in all groups (HE staining，×400).

图1 HE染色法观察各组肝脏的形态学特点

3 人参皂苷Rb1对肝组织细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的影响

与control组比较，model组大鼠肝脏组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD表达显著提高(P<0.01)；与model组比较，Rb1组与simvastatin组大鼠肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。Rb1组与simvastatin组比较无统计学意义,见图2。

Figure 2.The protein levels of NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18 and GSDMD in the rat liver of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsmodel group.

图2 各组大鼠肝脏组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD蛋白水平的比较

4 人参皂苷Rb1对肝组织细胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表达的影响

与control组比较，model组大鼠肝脏组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表达显著提高(P<0.01)；与model组比较，Rb1组与simvastatin组大鼠肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01),见表3。

表3 人参皂苷Rb1对大鼠肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表达量的影响

Table 3. Effect of ginsenoside Rb1 on the expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18 and GSDMD mRNA in liver of rats (Mean±SD.n=8)

GroupNLRP3Caspase-1IL-1βIL-18GSDMDControl1.001.001.001.001.00Model2.07±0.46∗∗3.88±0.15∗∗4.66±0.58∗∗5.43±0.53∗∗3.53±0.45∗∗Rb11.21±0.31#2.85±0.62#3.19±0.47#3.18±0.41##2.39±0.13#Simvastatin1.27±0.17#2.51±0.36##3.10±0.77#2.91±0.21##2.13±0.45##

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05;##P<0.01vsmodel group.

讨 论

中国传统医学对血脂异常的认识源于《黄帝内经》的“膏脂学说”[11-12]，与“痰浊”密切相关，痰浊与脾关系密切。《医宗必读》曰：“脾土虚弱，清者难升，浊者难降，留中滞膈，瘀而成痰”。若脾运化水液功能失常，导致水液内停，可聚湿成痰，痰阻气滞，日久则血行不畅，瘀血内生，痰瘀交阻，可见补脾气在治疗血脂异常中的重要性。

人参最早见于《神农本草经》，具有补脾益肺等功效。研究证明其有效成分人参皂苷具有降血脂、抗肝损伤等作用。人参皂苷Rb1、Rg3和Rg5均可以改善肝脏脂肪变性[13-15]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中 TG、TC和LDL-C 含量明显升高，HDL-C 明显下降，HE染色结果显示存在大量的脂质沉积和脂肪变性。与模型组比较，人参皂苷Rb1组大鼠血清中 TG、TC和LDL-C 含量显著降低，HDL-C 明显升高，肝细胞脂肪变性也有不同程度的恢复，提示人参皂苷Rb1在一定程度上可以起到降低血脂、减轻肝脏脂质沉积的作用。

细胞焦亡是程序性促炎形式的细胞死亡，最显著的特征是质膜完整性丧失和胞质物质释放到细胞外环境。细胞焦亡发生时，细胞膜内侧可形成1～2 nm非选择性的孔道，导致细胞内外的离子梯度消失，渗透压增加导致细胞外液进入胞内，细胞肿胀，最后导致细胞溶解[16-17]。研究发现，GSDMD蛋白是细胞焦亡中形成细胞孔道的特征性效应分子，其N末端片段的孔隙形成是发生细胞焦亡的驱动因素[18]。Shi等[19]发现，GSDMD-/-鼠细胞焦亡的数量明显减少，可见GSDMD蛋白在细胞焦亡中的重要作用。本实验通过Western blot法和RT-qPCR法检测GSDMD蛋白及其mRNA的表达情况以评价高脂血症大鼠肝脏细胞的细胞焦亡情况，并探讨人参皂苷Rb1对其的影响。实验结果显示，模型组大鼠肝脏的GSDMD蛋白及其mRNA显著升高;经过人参皂苷Rb1治疗后，大鼠肝脏的GSDMD蛋白及其mRNA表达显著降低，说明人参皂苷Rb1具有抑制高脂血症大鼠肝脏细胞焦亡的作用。

炎症小体调控细胞焦亡的发生，活化的NLRP3 炎症小体是一种基于NLRP3受体寡聚而形成的大分子复合物[20-21]。NLRP3蛋白通过NACHT结构域发生自我寡聚，借助PYD结构域与接头蛋白ASC发生相互作用，进而通过CARD 结构域招募胞内的caspase-1前体，并使之发生自我剪切，释放出具有水解酶活性的成熟caspase-1[22]。活化的caspase-1 将剪切底物 IL-1β 及 IL-18 前体转变成具有促炎功能的成熟 IL-1β 及 IL-18，并释放至胞外。研究发现ox-LDL促进巨噬细胞caspase-1活化，并且NLRP3/caspase-1通路参与ox-LDL诱导的人巨噬细胞裂解、DNA断裂以及IL-1β和IL-18的产生[23]，缺乏IL-1β可降低ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的的严重程度[24]。本研究Western blot与RT-qPCR结果表明，模型组大鼠肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显著升高，提示细胞焦亡参与了高脂血症大鼠肝细胞的损伤过程，而肝细胞焦亡相关因子NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18可能是引起炎症反应的重要因素。经过人参皂苷Rb1治疗后，大鼠肝脏的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显著降低，说明人参皂苷Rb1具有一定程度的抑制高脂血症大鼠肝脏细胞焦亡的作用。

综上所述，人参皂苷Rb1通过降低肝细胞焦亡相关因子的表达实现对高脂血症大鼠肝脏的保护作用，可能是其减轻肝脏脂质沉积的机制之一。本研究可能为临床防治肝脏相关疾病提供新靶点。