金铁锁优质种源组织培养研究

戚淑威，和桂青，周国华，和建英，程远辉，和琼姬，赵文林，陈 翠*

(1.云南省农业科学院 高山经济植物研究所，云南 丽江 674199;2.云南白药集团太安生物科技产业有限公司，云南 丽江 674199)

金铁锁(PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C. Y. Wu)为石竹科金铁锁属多年生植物，别名独定子、昆明沙参、蜈蚣七、金丝矮陀陀等，是分布在中国西南地区的特有单种属植物[1-3]，属于国家二级保护植物，现已作为珍稀濒危物种列于《中国植物红皮书中》[4-5]。集中分布在横断山区内，即滇西北的丽江、宁蒗、永胜、鹤庆、剑川、洱源、宾川、德钦、香格里拉、维西、兰坪和川西南的芒康、巴塘、稻城、乡城、得荣、木里、盐源、米易等地。此区域是金铁锁的分布中心。同时云南中部的东川、寻甸、武定、富民、昆明、易门、江川，东北部的会泽、宣威和贵州西北部的赫章、威宁也是一个相对集中的分布区域。而西藏东南部的林芝、察隅，滇南的个旧、红河及滇西的保山也有零星分布[6-7]。以根茎入药，具有除风湿、定痛、止血、祛瘀的功效，用于治疗风湿痹痛、胃痛、创伤初学、跌打损伤等[8-10]，同时也是云南红药胶囊、肿痛气雾剂、金骨莲胶囊、百宝丹胶囊等中成药的主要原料[11-12]。

金铁锁属于多年生草本植物，野生资源已濒临灭绝，目前的繁殖方式主要为人工栽培，生产上主要的繁殖方式为种子繁殖[13-19]，需要种植3～4年才能采收，然而我们在生产中发现，种植2年后金铁锁就开始出现不同程度的烂根现象，有时甚至绝收。我们针对这一现象进行了系统的研究和分析，发现金铁锁烂根的现象除与水分管理和病害有关外[20]，还与金铁锁的种源优劣有关，因此，本团队从西南各地区采集了50多份金铁锁种源，通过大小、重量、产量、抗病性等多方面的对比初步优选出5个金铁锁优质种源，具有根茎颜色黄褐色、粗壮、分支少、无病害等优点，为了稳定遗传金铁锁优质种源的优良性状，本团队对其中一个金铁锁优质种源进行了组织培养，希望通过组培的方式获得大量的金铁锁优质种源组培苗，用于解决金铁锁实际生产中所面临的瓶颈问题。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以金铁锁优质种源新鲜根茎为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 室内催芽 将金铁锁优质种源的新鲜根茎进行初步筛选，剔除弱、病、伤根，洗去泥沙，放入经过消毒处理的湿度为40%左右的粗木屑中，放置于20 ℃培养箱中催芽，待嫩茎长至15～18 cm时备用。

1.2.2 不同消毒时间处理 将茎芽从芦头基部切断，用剪刀剪成带1对腋芽的小茎段，放入烧杯中，烧杯中加入1/2的水和少许洗洁精，摇匀静置5 min，随后放在流水下冲洗1 h，淋干水分后，30个为一组，分别放入4个灭菌的烧杯中，按表1所示进行消毒处理，随后用无菌水清洗3～5次后接种于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中，每处理10瓶，3个重复。观察和统计不同消毒处理下的污染率及成活率，计算公式如下：

污染率/%=污染苗数/总苗数×100%

成活率/%=成活苗数/总苗数×100%

表1 金铁锁外植体消毒处理方案

1.2.3 丛生芽诱导培养 将金铁锁茎段接入不同浓度的6-BA和NAA的MS培养基中，激素浓度如表2所示，培养条件为：温度(23±2)℃，湿度30%～40%，光照强度2000 lx，光照时间10 h/d。观察并记录丛生芽个数、茎节长度、叶片数、株高及新生芽生长情况等。每瓶1苗，每组10瓶，3个重复。

表2 金铁锁丛生芽诱导试验方案

1.2.4 增殖培养 增殖培养所用培养基为丛生芽诱导最佳培养基，记录最大增殖倍数。

1.2.5 生根培养 在1/2MS培养基中加入不同浓度的NAA和IBA，如表3所示，观察不同浓度激素配比对金铁锁不定芽生根的影响，培养条件同上，观察并记录不定芽株高、叶数、根长、生根率等。每瓶10苗，10瓶为一处理，3个重复。生根率计算公式如下：

生根率/%=生根的茎数/接种的茎总数×100%

表3 金铁锁生根培养试验方案

2 结果与分析

2.1 室内催芽

将金铁锁新鲜根茎进行初步筛选、剔除弱、病、伤根，洗去泥沙，放入经过消毒处理的湿度为40%左右的粗木屑中，置于20 ℃培养箱中催芽。培养至3 d时可见芦头上的潜伏芽变绿并开始长大，20 d时嫩茎可达到15～18 cm，嫩茎白色，粗壮，叶片几乎完全展开，此时的嫩茎作为组培材料备用。

2.2 不同时间消毒处理

不同消毒处理结果如表4所示，4种消毒方案对金铁锁外植体的污染菌均有一定的杀菌作用。其中处理3的消毒方案最好，可以使污染率降至10%，成活率可达到93.3%，而处理4的污染率虽然很低，但小苗出现轻微褐化，成活率也有所降低，因此金铁锁外植体的最佳消毒方法为75%乙醇消毒30 s+0.1% HgCl2消毒8 min。

表4 不同消毒处理对金铁锁外植体消毒的效果比较

2.3 丛生芽诱导培养

将金铁锁外植体接入不同的丛生芽诱导培养基中，于培养室中培养30 d后观察并记录丛生芽个数、茎节长度、叶片数、株高及新生芽生长情况等，如表5所示，当单独添加NAA时，随着浓度的增加，可以产生大量的愈伤组织，但愈伤组织不能分化成丛生芽，激素组合均可诱导愈伤组织的产生，其中7号激素组合获得丛生芽最好，丛生芽数量平均可达到11.6个。如图1所示，茎节长度1.8 cm，长度适中，叶片绿色，数量多，平均可达到58片，株高可达到4.4 cm，除基部接近培养基的2叶增大变形外，其余叶片均正常；当6-BA的浓度达到1.5 mg/L时，虽然可产生大量愈伤组织，也可诱导丛生芽的产生，但产生的丛生芽出现玻璃化现象。因此，6-BA的浓度不宜超过1.5 mg/L，根据试验结果得到金铁锁丛生芽的最佳诱导培养基配方为：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

图1 丛生芽

表5 金铁锁丛生芽诱导结果

2.4 增殖培养

将丛生芽二次转接至丛生芽诱导培养基中，最大增殖倍数可达到29。

2.5 生根培养

将增殖的茎芽剪成带1对腋芽的茎段接入生根培养基中培养，培养至15 d时，部分茎基部开始膨大，茎皮胀开，呈紫色(生根前期)，如图2所示。30～40 d时开始生根，60 d时生根明显，须根触须状，3～5条，如图3所示，90 d时记录生根率、根长、株高、叶数等，结果如表6所示，不同激素配比对不定芽生根均有促进作用，处理9和处理10的平均株高可达11 cm以上，植株生长速度较快，但生根率不高，分别仅为36%和62%，而处理6的生根率可达到93%，平均株高可达到10.2 cm,平均叶片对数可达到9对，根长较均匀。因此，金铁锁的最佳生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.3 mg/L。

图2 生根前期(15 d)

图3 生根初期(60 d)

3 讨论

研究发现，外植体的取材部位应尽量选择中断幼嫩的茎段，不宜选择最上部分的嫰尖和最下部分的茎段，因为茎段太嫩易发生消毒时间太长所产生的褐化现象，最下部分的茎段因为接触地表，携带的病菌较多，易发生由于消毒不彻底而产生的污染问题，这与李岩[21]、陈杰[22]等的研究结果基本一致。在选择好茎段后应将叶片去除，仅保留叶片基部，防止后期叶片膨大变形，同时有利于腋芽的产生，促进植株的生长。除此之外，茎段插入培养基中不宜过深或过浅。

表6 金铁锁生根诱导结果

注：株高、叶数信息为平均值；根长等为最长和最短根长范围。

金铁锁组培过程中产生2种根型：一种为气生根，一种为基内根。气生根白色、丝状、数量极多，生长速度极快，生长于培养基的上面，当以叶片、烫伤茎段为组织材料时，或茎段未插入培养基中时易产生大量的气生根，经观察，产生气生根的组培苗生长缓慢，长势较差，往往覆盖于整个培养基表面，因此气生根的作用有待进一步的研究。基内根为金铁锁不定芽接入培养基后，在培养基内形成由下端茎段分化而成的根，初期呈触须状，随后延伸生长，后期可见根上有侧根产生，为金铁锁组培过程中的主要根型，产生基内根的组培苗健壮、长势较好。