鲜食葡萄表皮生物性危害因子及链格孢毒素分析

张伟，刘保友，臧宏伟，鹿泽启，张悦丽，刘传德*

（1. 山东省烟台市农业科学研究院/农业农村部果品质量安全风险评估实验室（烟台），山东烟台 265500；2. 山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，山东济南 250100）

葡萄是世界上栽培历史最久、产量最大的果树品种之一，富含丰富的糖、有机酸、维生素、氨基酸等营养成分，尤其是鲜食品种味美多汁、口感优良，深受广大消费者的喜爱。中国是世界葡萄生产大国，自2011年起鲜食葡萄产量已位居世界首位。根据国家统计局数据，2016年我国栽培面积达80.96万 hm2，产量达1262.94万 t[1]。我国葡萄以鲜食为主，栽培面积占总面积的80%，产量1080万 t[2]。‘巨峰’和‘红地球’是我国栽培面积最大的两个鲜食品种，2015年的面积分别是36.5万 hm2和14.6万 hm2[3]，尤其‘巨峰’是中国东部环渤海湾地区和南方产区的主栽品种。‘巨峰’葡萄是中熟品种，于高温多雨季节上市，且具有多汁、果刷短、容易脱离的特点，因此存在不耐贮运、易受机械损伤和杂菌污染等问题。大量研究表明，导致葡萄腐烂变质的病原菌大多数为真菌，具有病程短、低温贮藏中仍能生长繁殖并致病的特点[4]。国内外很多学者对葡萄及其制品中的真菌及毒素进行研究发现，葡萄在生产、贮运、加工过程中会被真菌侵染，进而产生对人类身体有害的毒素，其中主要有赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、展青霉素和链格孢毒素等。对于葡萄及制品中赭曲霉素和黄曲霉毒素研究的较多，而对于产生链格孢毒素的链格孢属真菌研究较少。链格孢毒素是由链格孢属真菌产生的一系列有毒代谢产物的总称，主要包括链格孢酚（alternariol，AOH）、链格孢酚甲基乙醚（alternariol monomethyl ether，AME）、链格孢霉素（al-tenuene，ALT）、腾毒素（tentoxin，TEN）、细交链孢菌酮酸（tenuzonicacid，TeA）等，链格孢霉毒素对人体健康存在诸多不利影响，如有报道其对人和动物有致癌、致畸、致突变性、急性毒性等多种毒性[5]。本文研究发现，鲜食葡萄的表皮上存在着能产生链格孢毒素的链格孢属真菌，对其进行产毒培养后能够产生毒素。基于链格孢毒素的毒性，食用无有效处理的健康葡萄对膳食亦存在一定的风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

自山东省潍坊市临朐县、昌邑区、寒亭区、安丘市和烟台市福山区、龙口市、海阳市的葡萄基地，采取成熟期葡萄样品50份，其中‘巨峰’样品30份（潍坊市15份、烟台市15份）、‘红地球’20份（潍坊市15份、烟台市5份）。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基（PDB）。

1.3 仪器与试剂

ZHJH-2112B水平流超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；RXZ型（多段编程）智能人工气候箱，宁波江南仪器厂；KQ-500DB数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LDZX-50FBS上海申安医疗器械厂；KS260摇床，德国IKA公司；CX21FS1光学显微镜，日本Olympus公司；LCMS-8040超高效液相色谱-串联质谱仪，岛津中国有限公司。

AOH、AME和TeA标准品（纯度＞98%，新加坡Pribolab公司）；ALT（纯度＞98%，加拿大TRC 公司）；乙腈（色谱纯，上海阿拉丁生化生化科技股份有限公司）；NaCl（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水MgSO4（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化生化科技股份有限公司）；琼脂（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；葡萄糖（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）。

1.4 试验方法

1.4.1 生物性危害因子分离和鉴定

葡萄成熟期，随机选取10穗健康果穗，在每穗上取2～3粒健康的带梗果粒。低温条件下于无菌袋中带回实验室，4 ℃冰箱保存，尽快分离。于超净工作台用灭菌的手术刀、镊子随机挑取约5 mm2果皮组织，接种到准备好的PDA平板上，每皿3块，1粒葡萄对应1皿。将样品倒置于培养箱25 ℃黑暗培养，待葡萄表皮周围萌出菌落，检查带菌组织块。带菌率/%=带菌组织皿数/总皿数×100。

将得到纯化的生物性危害因子接种到PDA固体培养基中，25 ℃恒温倒置培养5 d，在显微镜下观察其菌落、菌丝、分生孢子梗和孢子的形态特征，参照《真菌鉴定手册》[6]初步鉴定到属。

将得到的链格孢属真菌送至山东省农业科学院生物技术研究中心进行DNA提取、PCR扩增；OPA2-1核苷酸序列富于变化，可作为小孢子链格孢系统发育研究的一种有用的手段[7]；OPA2-1L，5'-TGCCGAGCTGTCAGATAATTG-3'/OPA2-1R，5'-GCCGAGCTGGTGGAGAGAGT-3'；测序后结果通过GenBank中核酸数据库进行比对，并利用软件MEGA5.1构建系统发育树进行同源性分析。

1.4.2 链格孢霉毒素的检测

将分离得到的A. alternata采用PDB培养液培养：每三角瓶50 mL培养液，高温灭菌后，于超净工作台中接种106孢子悬浮液，25～28 ℃静止或震荡培养14 d后，过滤菌丝干燥，并取5 mL上清液，20 mL 0.1%甲酸乙腈溶液震荡提取30 min，10000 r/min离心10 min，取1 mL上清液氮吹至干，30%乙腈水溶液复溶至1 mL，过0.22 µm滤膜上机测定；同时对这两个品种的健康葡萄匀浆进行检测。参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定 液相色谱一质谱/质谱法》（SN/T 4259—2015）测定AOH、AME、ALT和TeA 4种毒素。

2 结果与分析

2.1 鲜食葡萄表皮生物性危害因子鉴定

供试菌株于25 ℃恒温倒置培养5 d后，参照《真菌鉴定手册》形态学特征初步鉴定到属。链格孢属（Alternaria）：菌落平展、浅绿色或墨绿色；分生孢子梗直立、分枝屈膝状；分生孢子（深）褐色、链生，孢子形状变化较大，有横膈膜1～6个、纵隔膜0～5个，有喙。曲霉属（Aspergillus）：菌落黑色或深橄榄绿色，绒毛状，有放射性沟纹，反面黄至黄褐色；分生孢子梗由一根直立的菌丝形成，菌丝的末端形成球状膨胀成近球形的顶囊；分生孢子球形、壁粗糙。青霉属（Penicillium）：菌落多种颜色，绿色、黄绿色、灰绿色等；分生孢子梗直立，不分枝或于孢梗（近）顶端分枝，孢梗顶端或分枝顶端生瓶梗状产孢细胞，内壁芽生瓶梗式连续产生分生孢子，呈典型的帚状；分生孢子球形、卵形或椭圆形，单孢。枝孢属（Cladosporium）：菌落深橄榄棕色或（深）棕色、绒状会粉状、密集，生长缓慢、褶皱，反面橄榄黑色；分生孢子较小、链生、链状分枝处有个明显的深色柄。葡萄孢属（Botrytinia）：菌落稀疏、橄榄色-棕色，有的有气生菌丝；分生孢子梗粗大，顶端分支末端膨大，顶端生多个圆形分生孢子，分生孢子排列似葡萄穗状。

由图1可见，其中链格孢属真菌带菌率为14.00%；曲霉属真菌带菌率为57.00%；青霉属真菌带菌率为6.00%；枝孢属真菌带菌率为2.00%；葡萄孢属真菌带菌率为1.00%；其他（包括未萌发任何真菌的葡萄组织）为20.00%。葡萄表皮真菌中除了研究较多的曲霉属真菌外，链格孢属为第二大危害真菌。

图1 鲜食葡萄表皮真菌种类带菌率比较Figure 1 Comparison of rate of fungi in grape epidermis

2.2 鲜食葡萄表皮链格孢属真菌带菌情况比较

由表1看出，潍坊市15份样品和烟台市15份样品的‘巨峰’葡萄表皮的链格孢属真菌平均带菌率为20.00%和13.33%，‘红地球’葡萄的平均带菌率分别为6.67%、20%。

表1 鲜食葡萄果皮带菌率比较Table 1 Comparison of rate of Alternaria spp. in grape epidermis

2.3 链格孢属真菌菌株鉴定

将分离纯化的链格孢属真菌（Alternariaspp.）于PCA培养基28 ℃培养4～5 d后，参照《中国真菌志-链格孢属》[8]，观察真菌在培养基上的菌落形态、色泽、菌丝特征、孢子形态等形态学（图2），鉴定其为A.alternata；其主要特性是分生孢子短链生，分生孢子倒棍棒型、卵形，横膈膜1～5个，纵隔膜1～4个，支链一般长1～5个孢子。选取形态学鉴定为A. alternata的菌株YTFT进行OPA2-1测序，得到的序列与GenBank中已注册的序列进行BLAST，并用软件MEGA5.1分析得到系统发育树（图3），结果显示与Alternaria Alternatastrain QK14091823（Gen Bank编号为KT315516.1）聚在同一分支上；结合形态学进一步鉴定为A. alternata。

图2 Alternaria alternata 分生孢子及产孢表型Figure 2 Conidia and sporulation pattern of Alternaria alternata

图3 根据OPA2-1基因序列构建的菌株YTFT系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree of strain YTFT based on OPA2-1 sequences

2.4 菌株产毒培养及毒素检测

如表2选取代表性菌株5株，采用PDB配制培养液毒素培养，毒素检测结果显示在葡萄成熟期所分离到的A.alternata菌株均不产生ALT；3株菌株能产生TeA，含量为4～70.2 µg/L；2株菌株能产生AME，含量为0.3～0.4 µg/L；只有1株菌株产生AOH为4.1 µg/L。普通葡萄样品中未检测出这4种毒素。

表2 葡萄样品及真菌发酵液中链格孢毒素含量检测Table 2 Alternaria toxins detection of grapes and fermentation broth (Unit: µg/L)

3 讨论与结论

本研究对山东省烟台市和潍坊市50份‘巨峰’‘红地球’健康葡萄样品进行表皮生物性危害因子分离及鉴定，结果表明葡萄成熟期表皮存在的主要生物性危害因子为曲霉属、链格孢属和青霉属真菌，带菌率分别为57.00%、14.00%和6.00%；曲霉属及其产生的霉素的特性[9-12]、筛选[13-16]及在葡萄制品中[17-19]已引起足够的重视和研究；而对于链格孢属真菌，尤其是在健康葡萄表皮上的研究较少。本文分离出的葡萄表皮的链格孢属真菌主要为A. alternata，并对其进行产毒培养后能够产生AOH、AME和TeA，其中TeA的含量达到4～70.2 µg/L。宋蕤[20]、许灵春等[21]亦从葡萄中分离到链格孢属真菌；也有研究表明，链格孢属真菌还能够引发葡萄果实采后落粒[22]、贮藏期能够引起果粒腐烂[23-25]，当然也存在着适合发酵的乳酸菌[26]等有益菌。林玲等[27]随机抽取某农贸市场、批发市场的50份葡萄样品进行检测其中3份检出AME，测定值为0.25～8.53µg/kg；4份检出AOH，测定值为1.7～15.9 µg/kg。Scott等[28]对加拿大的24份葡萄酒进行了测定，其中红葡萄酒中AOH含量达0.03～5.02 µg/L、AME含量0.01～0.23 µg/L；还有研究报道德国某葡萄酒AOH、AME最高含量达7.60 µg/L和0.30 µg/L[29-30]。AOH和AME属于二苯-α-吡喃酮类化合物，其毒性相对较小，但具有诱变性和致癌性，有研究表明我国某地区食管癌高发与其有密切关系[31]；TeA属于四价酸类化合物，能导致动物急性中毒死亡，具有催吐及心血管毒性两种基本毒性，造成出血性胃肠病和循环系统损伤，从而致动物死亡[32]。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）对AOH和AME风险评估的结论为：随膳食摄入的AOH和AME对公众健康存在威胁[33]。尽管EFSA针对随膳食摄入的TeA对欧洲居民健康的风险评估结论为不存在潜在威胁；但我国国家风险评估中心的结论为随膳食摄入的TeA对2～6岁儿童存在健康威胁[34]。且有研究显示，TeA与AOH、AME具有协同作用[35]。2016年EFSA发布不同人群中链格孢毒素的膳食暴露风险评估报告中指出，学步儿童对AOH、AME、TeA和Ten四种链格孢霉毒素的膳食暴露量最大[36]。

由于链格孢属真菌能够在低温下繁殖生长，且葡萄多汁高糖，稍有碰伤或裂果便会给真菌提供丰富的营养加速其生长繁殖和扩散，所以随着运输、贮藏时间的增长真菌量会增加，产毒几率和产毒量也很有可能随之增加，膳食风险亦会随之增高。所以在葡萄鲜食及加工前应该对其进行有效的清洗以祛除其上的生物性危害因子及其残余物等潜在膳食风险因子。除了鲜食葡萄，酿酒品种在加工成葡萄酒的过程中是否会有潜在的链格孢属真菌存在，以及针对能产毒的真菌进行采前采后的防治以减少带菌率，仍需要进一步研究。本文通过研究发现，不同地区的‘巨峰’和‘红地球’葡萄的生物性危害因子的带菌率有所差异，这可能是他们所处的地理位置和气候变化有所差异，更有可能是在病害防治和田间管理上的差异引起的。同时还应研究在防治过程中引入的农药残留等二次污染及混合污染问题。

目前，国内外还没有针对链格孢毒素的限量标准，但EFSA已经对食品中链格孢毒素对人类健康的影响进行了相关风险评估工作，说明人们已经十分重视链格孢毒素可能引起的食品安全隐患。所以链格孢属真菌及链格孢毒素在葡萄防治及其加工过程中应成为继曲霉属真菌及其毒素之后又一关注重点。