miRNA-221/222基因多态性及肝功能指标与乙型肝炎病毒相关原发性肝癌的关联性研究*

韩竖霞 张平安 赵友云

1. 武汉大学人民医院检验科 (湖北 武汉， 430060) 2.湖北省中医院检验科

乙型肝炎病毒(HBV)相关原发性肝癌(HBV-PHC)具有恶性程度高、发展速度快、治疗困难、生存期短、死亡率极高的特点，是世界上第五位常见的肿瘤[1]。HBV感染后可出现不同的疾病转归，如隐匿性肝炎、急性肝炎、慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)或PHC[2]。微小RNA(miRNA)是近年来发现的一类普遍存在于动植物体内的非编码、短序列的小分子RNA，许多研究发现，疾病的发生、发展不仅与基因的突变和重排有关，也与miRNAs的调控密切相关[3]。miRNA-221/222位于染色质Xp11上，其中miRNA-221可以在所有组织中表达，已知其可靶向许多关键性肿瘤抑制位点。许多研究已证实miRNA-221/222在PHC的发生、发展的各个方面起重要作用[4]。但是，关于miRNA-221/222基因多态性与HBV-PHC的发生是否相关却鲜有报告。本研究通过分析HBV感染后不同转归的患者中miRNA-221/222基因多态性及肝功能指标的差异，评估miRNA-221/222基因多态性及肝功能指标在HBV-PHC的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 295例患者均为2015年1月至2017 年12月在该院住院的患者，其中HBV-PHC患者94例、LC患者104例、CHB患者97例。HBV-PHC组男72例，女22例，年龄30～81岁，平均54.45岁；CHB组男66例，女31例，年龄25～78岁，平均51.94岁；LC组男74例，女30例，年龄21～78岁，平均54.55岁。各组患者在性别和年龄方面比较，差异无统计学意义。

1.2 诊断标准 CHB的诊断标准:依据2015年中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的标准。LC的诊断标准：依据2015年中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的标准，同时有临床提示或组织学检测存在肝硬化的证据；病因学明确的HBV感染的证据；通过病史或相应的检查予以明确或排除其他常见的能引起肝硬化的病因如HCV感染、酒精和药物等。PHC的诊断标准：参照2011年中国卫生部医政司修订的PHC诊疗规范中的标准。①具有肝硬化以及HBV感染的证据。②典型的HCC影像学特征：a.如果肝脏占位肿块直径≥2cm，CT和MRI两项影像学检查中有一项显示肝脏占位性病变具有上述肝癌特征；b.如果肝脏占位肿块直径为1～2cm，则需要CT和MRI两项影像学检查都显示肝脏占位性病变具有上述肝癌特征，③血清甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L持续1个月或≥200 μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高。临床诊断为HCC，要求同时满足以下条件中的①+②a两项或者①+②b+③三项。

1.3 排除标准 均排除合并其他嗜肝病毒感染的肝炎或合并HIV感染者；伴有心、肾、肺、血液、代谢及胃肠道严重原发病者;不能合作或精神病患者；孕妇或哺乳期妇女；过敏体质或多种药物过敏的患者。

1.4 肝功能指标检测 包括肝功能8项指标(ALT、AST、 ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb)，由罗氏module P800全自动生化分析仪检测。

1.5 基因组DNA的提取及miRNA-221/222基因分型 用基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司生产)提取人类基因组DNA，用超微量核酸分析仪测定DNA含量，然后-20℃保存备用。根据人类miRNA-221/222基因rs2858061位点C/G和rs2858059位点C/T，采用Vector NTI 11.0软件设计引物和MGB探针序列(见表1)，并同时标记FAM和VIC荧光集团作为基因分型标记，合成引物及探针，利用双重FQ-PCR技术同步检测标本中miRNA-221/222基因rs2858061位点C或G，rs2858059位点C或T。

表1 FQ-PCR的引物和探针序列

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件包对ALT、AST、 ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb数据分布进行正态性检验。数据不服从正态分布的检测值采用中位数(四分位数间距)[M(P25～P75)]描述。组间差异比较采用非参数Kruskal-WallisH及Mann-WhitneyU检验；计数资料采用率(%)描述，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者肝功能结果 见表2。3组患者8项结果比较经Kruskal-WallisH检验，差异均有统计学意义(P<0.01)。其中HBV-PHC组患者GGT、ALP和AST水平明显高于CHB组和LC组，差异有统计学意义(P<0.05),但CHB组与LC组之间无差异(P>0.05)；3组间ALT和TP水平差异均有统计学意义(P<0.05)；HBV-PHC组TBil、DBil、Alb水平与LC组无显著性差异(P>0.05)。

表2 肝功能指标在3组患者间的比较 [M(P25～P75)]

2.2 miRNA-221/222基因多态性的分布情况 见表3。由表3可见，在miRNA-221基因rs2858061位点中，与CC基因型相比，CG基因型和GG基因型在HBV-PHC组、CHB组和LC组中均无统计学差异(P>0.05)；等位基因C和G的分布在3组中无统计学差异(P>0.05)。miRNA-222基因rs2858059位点中，与TT型相比，CT基因型和CC基因型在HBV-PHC组、CHB组和LC组中均无统计学差异(P>0.05)；等位基因C和T的分布在3组中均无统计学差异(P>0.05)。

表3 miRNA-221/222基因多态性在3组患者间的分布比较 [n(%)]

3 讨论

PHC发病原因尚不明确，许多研究显示，HBV感染与肝癌的发生存在较强的相关性。虽然现代治疗方式的应用使得其临床疗效得到了显著提升，但因其早期的检出率和确诊率较低，导致其死亡率依然居高不下[5，6]。 因此PHC的预防、诊断及治疗受到各界关注，寻找其潜在的分子标志物等相关的研究已成为热点。

随着检测技术的改进和检测经验积累，肝功能相关指标检验的准确性、敏感性及稳定性均得到了显著提升，应用范围也不断拓展，已成为肝脏疾病诊断和治疗的重要内容[7]。目前临床对于肝功能监测常采用的指标主要有ALT、AST、ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb 8 种。本研究显示，HBV-PHC组GGT、ALP和AST水平明显高于CHB组和LC组，差异有统计学意义(P<0.05),CHB组与LC组之间无差异(P>0.05)；3组之间ALT和TP水平均有显著性差异(P<0.05)。分析原因，PHC患者的肝功能会出现严重紊乱，而ALT、AST是主要存在于肝细胞中的两种酶，前者多存在于细胞浆内，后者多存在于细胞浆内的线粒体中，当肝细胞受到损伤时，ALT被释放后进入血液中从而使其血中浓度出现升高，当肝细胞损伤严重，线粒体受到损伤时，AST也会渗入血液中，而使其浓度升高。血清中的GGT主要来自肝胆组织，健康人血清中的 GGT 水平很低，而胆汁中的水平很高。当肝细胞受到炎症、肿瘤或胆汁淤积的刺激时，GGT的合成便增加，血清中的 GGT 水平会明显升高。ALP在肝内外梗阻性黄疸时一般会增高。研究中还发现，HBV-PHC组患者的TBil、DBil、Alb水平与LC组比较无显著性差异(P>0.05)。TBil 和 DBil 可以判断是否存在溶血及肝胆系统的功能状态，普通肝病、胆囊炎、精神因素、胆囊结石等都可以造成胆红素代谢障碍,从而引起胆红素升高，在诊断原发性肝癌时无特异性，与许多研究一致。 因此，本研究显示，GGT、ALP、AST、ALT、TP可以用于HBV-PHC与LC的鉴别诊断,其中ALT和TP还可以用于乙型肝炎肝硬化的早期鉴别。

miRNA是一种广泛存在于真核生物中、大小为20～22个核苷酸的内源性单链小分子RNA。它在生物进化的过程中呈现高度保守的特点，在细胞中具有时空特异性表达模式。虽然此类RNA不编码蛋白，但是其通过与靶基因序列特异性相互作用，在转录和翻译水平中调节相关的基因表达，以此参与生物的细胞增殖和凋亡、器官形成及生长发育调控等进程[8，9]。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现，许多研究显示多种miRNAs参与了PHC的形成、演进以及转移过程。miRNA-221/222位于染色质Xp11，miRNA-221与miRNA-222拥有共同基因序列和靶基因，且能与目标基因特定序列互补配对，此段核苷酸吻合度最为重要，与靶mRNA结合起重要作用。已有研究显示miRNA-221/222与肝癌的发生密切相关,与正常组织相比，PHC中有大量异常表达的 miRNAs[10，11]。SNP是在基因水平上由单个核苷酸的变异而引起的DNA序列的多态性，也是最常见的一种可遗传的变异。越来越多的研究表明，miRNA相关的单核苷酸多态性(miRNA-SNP)可以通过影响miRNA的合成、与靶基因结合等方式参与基因功能的调节,影响细胞的调控过程，对许多肿瘤细胞组织，如甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的表达有不同程度的上调或下调，在肿瘤发病机制中发挥重大作用,这也是目前生命科学领域的研究热点[12～16]。

本研究发现，miRNA-221基因rs2858061位点中，几个基因型的分布在3组中差异均无统计学意义(均P>0.05)。虽然本研究未证实miRNA-221/222基因多态性与HBV-PHC的发生有一定的相关性，但是由于研究病例的数量及人群的限制，可能会有一定的片面性。未来会加大其他病例的收集和分析研究,进一步研究miRNA基因及其靶点的多态性与HBV-PHC的相关性,探索肝癌早期诊断的新标志，并为肝癌的病因、治疗和预后提供新的思路。