HPLC法同时测定三叶青块根中6个黄酮类成分的含量Δ

李彩凤，胡欣，金鹏飞，李清，孙淑仃，毕开顺#，付宏征（.沈阳药科大学药学院，沈阳006；.北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 009；.北京医院药学部，北京 0070）

三叶青即葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg.），又名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠，全草均可入药，以地下块根药用效果最好，具有清热解毒、活血散结、消炎止痛、祛风化痰、理气健脾等功效，常用于小儿高热惊厥、痢疾、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性脑膜炎、毒蛇咬伤、扁桃体炎、跌打损伤等疾病的治疗[1]。现代药理学研究发现，三叶青具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、保肝、解热、镇痛以及免疫调节等药理作用[2]。为了更好地开发利用三叶青资源，需对三叶青中的主要成分进行质量控制。目前，从三叶青中发现的化学成分包括黄酮类、酚酸类、三萜类、甾类、二苯乙烯类、鞣质类等[3-5]。相关研究采用高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（HPLC-Q-TOF-MS）或超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法（UPLC-MS/MS）法来测定三叶青中的化学成分[6-7]，但此类仪器价格昂贵，难以普及。另有研究采用HPLC法测定三叶青中化学成分的含量，但所测成分较少[8-10]。为了更好地控制三叶青的质量，本研究选择三叶青中具有抗肿瘤活性[11]的黄酮类成分芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚作为质控成分，建立HPLC法同时测定三叶青中这6个黄酮类成分的含量，以期为三叶青质量标准的制订提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Alliance e2695 HPLC仪（美国沃特世公司）；MS-204TS电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；K-210旋转蒸发仪（瑞士布琦公司）。

1.2 药品与试剂

三叶青药材从浙江省台州市当地药农购入（批号：20171012、20171020、20171107），经北京大学医学部药学院天然药物化学系付宏征教授鉴定为真品；芦丁对照品（批号：201832，纯度：98.21%）、异槲皮苷对照品（批号：201807，纯度：97.26%）、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（批号：201805，纯度：96.63%）、紫云英苷对照品（批号201815，纯度：99.33%）、槲皮素对照品（批号201819，纯度：97.94%）、山柰酚对照品（批号：201814，纯度：98.69%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Alliance SilGreen C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脱；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；进样量：15µL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚对照品适量，置于不同量瓶中，加甲醇溶解制成质量浓度均为1.0 mg/mL的对照品贮备液；精密移取6种对照品贮备液适量，混合制成含有芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚质量浓度分别为217.77、123.75、132.31、46.30、57.50、33.66 µg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取三叶青块根适量，粉碎，精密称取三叶青粉末约4.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，称质量，超声（功率：200 W，频率：40 kHz）60 min，放冷至室温，称质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，滤液用旋转蒸发仪蒸干（40℃），用甲醇转移并定容至2 mL量瓶中，0.22µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取混合对照品溶液和供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚各峰之间分离度良好，分离度均＞1.5，理论板数以芦丁峰计＞40 000。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 线性关系考察 分别取混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成系列质量浓度混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（y）、各成分质量浓度为横坐标（x）进行线性回归。结果，6个黄酮类成分在各检测质量浓度范围内线性关系均良好，6个黄酮类成分的线性关系结果见表2。

2.3.3 检测限与定量限试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液加甲醇逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。当信噪比为3∶1时得检测限，信噪比为10∶1时得定量限。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚的检测限分别为0.217 8、0.123 8、0.066 2、0.046 3、0.191 7、0.112 3 µg/mL，定量限分别为 0.435 6、0.247 5、0.165 4、0.154 3、0.575 0、0.421 2 µg/mL。

表2 6个黄酮类成分的线性关系结果（n＝6）Tab 2 Linear relationship of 6 flavonoids（n＝6）

2.3.4 精密度试验 取“2.2.1”项下混合对照品适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分峰面积。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚峰面积的RSD分别为0.21%、0.63%、0.31%、0.47%、0.45%、0.67%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批三叶青（批号：20171012），平行取样6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积并计算含量。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚含量的RSD分别为1.30%、1.20%、1.77%、1.67%、1.80%、1.87%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：2017-1012），于室温下放置0、2、6、8、10、12、24 h后，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚峰面积的RSD分别为2.18%、3.20%、3.08%、1.27%、1.14%、2.44%（n＝7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 加样回收率试验 取已知含量的三叶青粉末（批号：20171012）9份，精密称定适量，分别按各成分已知含量的50%、100%、150%加入混合对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚的平均加样回收率分别为96.23%、86.88%、97.51%、97.67%、97.50%、87.46%，RSD分别为1.85%、1.90%、1.84%、1.94%、1.25%、2.01%（n＝9），回收率试验结果见表3。

表3 回收率试验结果Tab 3 Result of recovery tests

2.3.8 耐用性试验 取同一供试品溶液（批号：20171012），分别在流速0.8、1.0、1.2 mL/min，柱温 30、35、40℃，流动相磷酸浓度0.15%、0.1%条件下进样分析，考察各成分峰之间的分离情况。结果，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚之间分离度均＞1.5，各峰理论板数均大于10 000，表明该方法耐用性好。

2.3.9 样品含量测定 3批样品分别各取适量，粉碎，取粉末约4.0 g，各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积并计算各成分含量，样品含量测定结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

笔者前期首先将6个成分的对照品溶液在210～400 nm波长下进行紫外扫描，结果发现，这6个成分在360 nm波长处均有较大吸收，因此选择360 nm为检测波长。

3.2 色谱条件的选择

笔者前期考察了不同性能填料的色谱柱Alliance SilGreen C18和MACHEREY-NAGEL NUCLEOSIL C18的分离效果，并从对称因子、分析时间、分离度等方面对三叶青供试品溶液进行综合评价，最终选择SilGreen C18色谱柱，该色谱柱分离的峰形良好，分析时间较短，且在较低柱压下能实现快速高效的分离。笔者还考察了甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作为流动相，以及不同浓度磷酸水溶液0.1%、0.15%、0.2%对6个成分分离的影响，结果发现，乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相时具有良好的分离效果。

综上所述，本研究建立的HPLC方法准确度好、稳定性强，能够实现对三叶青块根中6个黄酮类成分含量的同时测定，可为三叶青质量控制标准的建立提供参考。但本方法只对三叶青中黄酮类成分进行了定量分析，后续还应对三叶青中其他化学成分（酚酸类、三萜类、甾类和二苯乙烯类等）进行定量分析，建立三叶青中多指标成分含量的分析方法，进一步完善三叶青质量标准。