细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究

谭拥军 王坤 余雳 黄小芹 陈燕 谭桂湘

摘   要：细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽，该多肽一般由不多于30个氨基酸组成. 针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽，设置不同浓度梯度，分别处理多种肿瘤细胞，荧光显微镜下观察不同作用浓度下细胞中绿色荧光的强弱，并通过流式细胞仪检测含有荧光的细胞数. 结果表明：两种细胞穿膜肽具有不同的细胞选择性. CPP33在作用浓度为10 μmol/L时能观察到较强的荧光选择性，流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于50%，CPP44在作用浓度为10 μmol/L时能观察到较强的荧光选择性，流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于60%. 并且随着作用浓度的增加，两种细胞中含有荧光的细胞数不断上升. 因此这种针对肿瘤细胞的选择性穿膜肽可能为小分子药物在体内的精确递送提供一种新的方法.

关键词：肿瘤选择性穿膜肽;肺癌;肝癌;浓度梯度;小分子药物

中图分类号：Q784                                    文献标志码：A

Study on Transmembrane Delivery of

Tumour Lineage-homing Cell-penetrating Peptides

TAN Yongjun，WANG Kun，YU Li，HUANG Xiaoqin，CHEN Yan，TAN Guixiang

（College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract： Cell penetrating peptides are small molecular peptides that can penetrate cell membranes without damaging the structure of cell membranes. These peptides are generally composed of no more than 30 amino acids. Two tumor lineage-homing cell-penetrating peptides labeled with FITC for lung cancer and liver cancer were synthesized and added to different kinds of tumor cells with different concentration gradients. The number of cells containing fluorescence was detected. The results approved that the two kinds of cell-penetrating peptides showed different cell selectivity. The fluorescence specificity of CPP33 was strong at the concentration of 10 μmol/L. The number of cells containing fluorescence was about 50% by Flow cytometer. The fluorescence specificity of CPP44 was strong at the concentration of 10 μmol/L. The number of cells containing fluorescence was about 60% by Flow cytometer. Moreover， the number of cells containing fluorescence increased with the increase of concentration， respectively. In conclusion， these tumor lineage-homing cell-penetrating peptides may provide a new method for precise delivery of anticancer molecules in vivo.

Key words： tumor lineage-homing cell-penetrating peptides;lung cancer;liver cancer;concentration gradient;anticancer molecules

细胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一类由氨基酸组成具有穿透细胞膜能力的小分子多肽，其中氨基酸的个数一般不多于30[1-2].CPPs最早从人HIV-Ⅰ的TAT蛋白中发现，该蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段区域蛋白转导域（protein transduction domains，PTD），该区域是一个包含13个氨基酸可溶性肽段[3-4]. 随着研究的深入，细胞穿膜肽的数量不断增加.

CPPs的分类有多种，可以根据其来源或序列的不同分为不同的亞类[5]，还可以依据肽链所含脯氨酸的多少分为富含脯氨酸和多脯氨酸两种[6]，如SAP，该多肽中的脯氨酸含量高达50%. 除此之外，由于不同穿膜肽进入细胞后，会引起细胞内Ca2+的不同变化，可以将细胞穿膜肽分为两亲性和非两亲性，两亲性细胞穿膜肽会引起细胞内Ca2+不同程度的提高，而非两亲性细胞穿膜肽在转运过程中几乎不会对细胞内Ca2+产生影响[7]. 不同于普通的分类，还有一种特殊类型的细胞穿膜肽，该类穿膜肽由两条及以上的肽链组成，如转运蛋白、PEVEC、MAP和PEP-1[8].

近年来，CPPs作为分子载体用于药物递送系统的应用已经越来越广泛.通过融合的方法可以携带核酸[9]、蛋白[10]、小分子化合物[11-12]、核磁共振成像载体[13]等进入细胞. Meyer-Losic等[14]将人工合成的一种功能肽DPV1047 Vectocell与SN38通过物理混合的方式制成复合物，通过对溶解性、毒性、稳定性的研究证明其具有很好的抗肿瘤作用，并且在动物实验上取得明显的效果.

由于大部分细胞穿膜肽没有选择性，因此针对特定细胞的靶向治疗还停留在初级阶段.并且现有的肿瘤细胞选择性穿膜肽也是建立通过把已知非选择性穿膜肽与识别细胞表面抗原的抗体[15]连接或者与其他针对某种细胞的选择性分子形成复合物产生的，这种连接不仅受到所连分子理化性质的限制，对所针对的肿瘤细胞也具有一定的局限性. 近期Kondo等人[16]通过mRNA展示技术构建多肽文库，成功获得了肿瘤选择性细胞穿膜肽，并利用合成的肿瘤选择性穿膜肽对比多种不同肿瘤验证了其选择性效果.

本文分别研究了肺癌细胞选择性穿膜肽CPP33、肝癌细胞选择性穿膜肽CPP44，经FITC标记后，不同作用浓度下，在肿瘤细胞A549和HepG2等5种不同细胞中的细胞选择性，观察了不同浓度下细胞内的荧光强弱，通过流式细胞仪分析了不同肿瘤细胞中含有绿色荧光的细胞数目，确认了CPP33、CPP44两种细胞穿膜肽具有明显的细胞选择性.

1   材料与方法

1.1   材   料

乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、骨肉瘤细胞U2OS来源于American Type Culture Collection（ATCC）;DMEM培养基、1640培养基以及血清均为GIBCO公司产品;Flow Cytometer由BECKMAN COULTER公司提供;FITC标记多肽由上海淘普生物科技有限公司合成，序列信息如下：

CPP33： RLWMRWYSPRTRAYG

CPP44： KRPTMRFRYTWNPMK

1.2   方   法

1.2.1   不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽显微观察

在含有MCF-7、HepG2、A549、HeLa、U2OS 5种肿瘤细胞的10 cm培养盘中加入含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的DMEM培养液后将培养盘放入37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，待细胞密度长至90%时，吸出培养液，用1X无菌PBS漂洗两次，每盘加入1 mL 1X胰酶放入培养箱中消化2 min，待细胞变圆脱落时，加入1 mL含10% FBS的DMEM培养液轻轻吹打数次至单个细胞，并用培养液配成单个细胞悬液，以每孔1.2×106个细胞接种到6孔板中，每孔总体积为2 mL，放入培养箱中培养.

在超净工作台中分别向CPP33、CPP44合成的多肽中分别加入4.22 mL、4.16 mL无菌ddH2O将其稀释至400 μmol/L.待6孔板中的细胞密度长至70%时，吸出培养液，用无菌PBS漂洗两次，按终浓度分别为2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L设置浓度梯度，用含FBS培养液按照上述浓度梯度稀释多肽加入到培养板中. 剩余2孔只加2 mL培养液用作对照，放入培养箱中培养，6 h后观察细胞的荧光强度，并以穿膜数超过50%为有效穿膜肽统计穿膜率.

1.2.2   流式细胞仪检测细胞荧光

按照上述方法培养细胞，待细胞密度长至90%时，每盘加入1 mL 1X胰酶放入培养箱中消化

2 min，待细胞变圆脱落时，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培养基轻轻吹打数次至单个细胞，并用培养液配成单个细胞悬液，以每孔7 × 106个细胞接种到10 cm培养盘中，每种细胞按照终浓度10 μmol/L加入FITC标记的穿膜肽，6 h后收集细胞.

吸去培养皿中的培养液，用无菌PBS漂洗两次，加入1 mL lX胰酶，置于培养箱中消化2 min，待细胞变圆脱落时，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培养基轻轻吹打数次至单个细胞.将细胞收集在2 mL Eppendorf管中，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min，去除上清胰酶培养基混合物. 加入PBS漂洗两次，4 ℃，1 000 r/min离心5 min. 加入1 mL无菌PBS，使其细胞密度为1 × 106/mL，冰上存放用于流式检测，并取相同培养条件下，未加穿膜肽的细胞作对照.

流式分析，创建Forward Scatter（FSC）vs. Side Scatter（SSC）峰图，将对照样品放入“test”管，调节FSC和SSC电压使细胞集中于FSC vs.SSC 峰图内. 创建一个门（R1）包括所有的细胞，基于门（R1）创建Fluorescence Channel 1（FL1）vs. SSC 峰图，调节FL1 PMT电压值以便DEAB“control”样品峰分布在102内. 取下对照样品，换上待检测样品，保持参数不变，出现在102以外的Polt即为含绿色荧光的细胞，分析约100 000个细胞，记录每种细胞中含绿色荧光的细胞比例.

2   实验结果

2.1   不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽显微分析

2.1.1   不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽显微观察

对比两种肿瘤细胞选择性穿膜肽在5种不同肿瘤中绿色荧光的强弱. 当肿瘤细胞浓度为2 μmol/L时，CPP33和CPP44在5种细胞中几乎没有荧光;当肿瘤细胞浓度为5 μmol/L时，5种细胞的绿色荧光亮度有所提高，加有CPP33的細胞中，A549细胞中的绿色荧光亮度最高;加有CPP44的细胞中，HepG2细胞中的绿色荧光亮度最高，两种穿膜肽在两种细胞开始出现明显的选择性. 当肿瘤细胞浓度为10 μmol/L时，CPP33、CPP44两种穿膜肽在两种细胞中的绿色荧光亮度提高明显，而在其他细胞中的绿色荧光亮度仍然很低;当肿瘤细胞浓度增大到20 μmol/L时，CPP33、CPP44两种穿膜肽在A549、HepG2两种细胞中的绿色荧光亮度有所增加，但增加幅度较10 μmol/L时有所减少，并且其他细胞中的绿色荧光亮度也有不同幅度提高. 如图1所示.

2.1.2   不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽荧光细胞

计数

当肿瘤细胞浓度为2 μmol/L时，除A549细胞，CPP33在其余4种细胞中产生荧光的细胞数均低于5%;当肿瘤细胞浓度为5 μmol/L时，加有CPP33的细胞中，A549细胞中产生荧光的细胞数最高，大于20%;当肿瘤细胞浓度为10 μmol/L时，CPP33在A549细胞中产生荧光的细胞数大于50%;当肿瘤细胞浓度增大到20 μmol/L时，CPP33在A549细胞中产生荧光的细胞数约为60%. 如图2（a）（b）（c）（d）所示. 当肿瘤细胞浓度为2 μmol/L时，CPP44在5种细胞中产生荧光的细胞数均不超过2.4%;当肿瘤细胞浓度为5 μmol/L时，加有CPP44的细胞中，HepG2细胞中产生荧光的细胞数最高，大于7.5%;当肿瘤细胞浓度为10 μmol/L时，CPP44在HepG2细胞中产生荧光的细胞数大于50%;当肿瘤细胞浓度增大到20 μmol/L时，CPP33、CPP44两种穿膜肽在A549、HepG2两种细胞中产生荧光的细胞数大于60%. 如图2（e）（f）（g）（h）所示.

2.2   流式细胞仪检测细胞荧光百分比

图3为不同肿瘤细胞中波长超过102 nm的细胞数与细胞总数的百分比.在绿色荧光通道（FL1）中，流式分析10 μmol/L CPP33处理6 h后，5种细胞中A549细胞中含荧光细胞百分比最高，见图3（b），大约分别是其他4种细胞（HeLa、MCF-7、U2OS、HepG2）荧光数目的兩倍，分别如图3（a）（c）

（d）（e）所示. 同样，流式分析10 μmol/L CPP44处理6 h后，5种细胞中HepG2细胞中含荧光细胞百分比最高，见图3（j），大约分别是其他4种细胞（HeLa、A549、MCF-7、U2OS）荧光数目的两倍，分别如图3（f）（g）（h）（i）所示.

3   结   论

本实验对两种不同肿瘤细胞选择性穿膜肽进行研究，运用不同细胞对比，发现CPP33穿膜肽能够有效穿过肺癌细胞A549的细胞膜进入细胞. 同样，CPP44穿膜肽能够有效穿过肝癌细胞HepG2的细胞膜进入细胞.两种穿膜肽均有较高肿瘤细胞选择性.

细胞穿膜肽作为有效的药物运输载体已经在临床有所运用，但由于细胞种类的多样性和每种细胞的复杂性，目前针对特定细胞的选择性穿膜肽只有少数被发现和应用，对于特殊细胞的穿膜肽的开发还处于初级阶段.相对于非选择性细胞穿膜肽，CPP33、CPP44具有良好的细胞选择性，因此CPP33、CPP44可能成为有效的肿瘤选择性药物运输载体，这也为实现肿瘤细胞的靶向治疗提供了广阔的前景.

参考文献

[1]    ZHANG D，WANG J，XU D. Cell-penetrating peptides as noninvasive transmembrane vectors for the development of novel multifunctional drug-delivery systems[J]. Journal of Controlled Release，2016，229：130—139.

[2]    BOLHASSANI A. Potential efficacy of cell-penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in cancer [J]. Biochimca et Biophysica Acta，2011，1816（2）：232—246.

[3]    VIVES E，BRODIN P，LEBLEU B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus [J]. The Journal of Biological Chemistry，1997，272（25）：16010—16017.

[4]   GUIDOTTI G，BRAMBILLA L，ROSSI D. Cell-penetrating peptides：from basic research to clinics [J]. Trends in Pharmacological Sciences，2017，38（4）：406—424.

[5]    KOREN E，TORCHILIN V P. Cell-penetrating peptides：breaking through to the other side[J]. Trends in Molecular Medicine，2012，18（7）：385—393.

[6]    PUJALS S，SABIDO E，TARRAGO T，et al. All-D proline-rich cell-penetrating peptides：a preliminary in vivo internalization study[J]. Biochemical Society Transactions，2007，35（4）：794—796.

[7]    LORENTS A，KODAVALI P K，OSKOLKOV N，et al. Cell-penetrating peptides split into two groups based on modulation of intracellular calcium concentration[J]. The Journal of Biological Chemistry，2012，287（20）：16880—16889.

[8]    PETRESCU A D，VESPA A，HUANG H，et al. Fluorescent sterols monitor cell penetrating peptide Pep-1 mediated uptake and intracellular targeting of cargo protein in living cells [J]. Biochimica et Biophysica Acta，2009，1788（2）：425—441.

[9]    BOISGUERIN P，DESHAYES S，GAIT M J，et al. Delivery of therapeutic oligonucleotides with cell penetrating peptides[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2015，87：52—67.

[10]  LIU J，GAJ T，PATTERSON J T，et al. Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering [J]. PLOS One，2014，9（1）：e85755.

[11]  LINDGREN M，ROSENTHAL-AIZMAN K，SAAR K，et al. Overcoming methotrexate resistance in breast cancer tumour cells by the use of a new cell-penetrating peptide [J]. Biochemical Pharmacology，2006，71（4）：416-425.

[12]  WANG F，WANG Y，ZHANG X，et al. Recent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery [J]. Journal of Controlled Release，2014，174：126—136.

[13]  LEWIN M，CARLESSO N，TUNG C H，et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells[J]. Nature Biotechnology，2000，18（4）：410—414.

[14]  MEYER-LOSIC F，NICOLAZZI C，QUINONERO J，et al. DTS-108，a novel peptidic prodrug of SN38：in vivo efficacy and toxicokinetic studies[J]. Clinical Cancer Research，2008，14（7）：2145—2153.

[15]  TURCHICK A，HEGAN D C，JENSEN R B，et al. A cell-penetrating antibody inhibits human RAD51 via direct binding [J]. Nucleic Acids Research，2017，45（20）：11782—11799.

[16]  KONDO E，SAITO K，TASHIRO Y，et al. Tumour lineage-homing cell-penetrating peptides as anticancer molecular delivery systems [J]. Nature Communications，2012（951）：1—13.