非洲猪瘟病毒结构蛋白在病毒感染过程中的作用

欧云文 刘俐君 代军飞 马炳 张永光 张杰

（1. 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046；2. 开江县动物疫病预防控制中心，达州 636250；3. 达州市动物疫病预防控制中心，达州 635099）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、烈性、出血性猪传染病，急性感染死亡率为100%［1]。急性和亚急性ASF常在多种器官上表现出严重的血管性病变，如肾脏出血、淋巴结弥漫性出血、肺水肿、弥散性血管内凝血和血小板减少等。其主要临床症状是高热、皮肤发绀、有出血点、呕吐和便血等［2]。因此，ASF被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的法定动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病［1]。1921年，在非洲（肯尼亚）首次发现ASF。1957年，欧洲（葡萄牙）首次暴发ASF疫情，随后蔓延到全球多个国家和地区，如俄罗斯、乌克兰、爱沙尼亚、拉脱维亚、波兰等东欧国家和高加索地区［3-8]。2018年以来，全球有波兰、俄罗斯、拉脱维亚、捷克、罗马尼亚、摩尔多瓦、乌克兰、匈牙利、保加利亚、比利时、科特迪瓦、南非、赞比亚和中国等14个国家发生ASF疫情，国际疫情形势十分严峻［9]。2018年8月，辽宁省出现我国首例ASF疫情［10]。截至目前，在全国23个省（市、自治区）先后发生100起疫情，给我国养猪业造成严重的经济损失。

ASFV是一种有囊膜的双链DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一虫媒DNA病毒［11]。家猪、野猪和软蜱均为ASFV的宿主，猪单核细胞-巨噬细胞为ASFV主要的靶细胞［12-13]。病毒基因组全长约为170-193 kb，基因组中间是一段长度约为125 kb的保守区［14-15]。基因组拥有150-167个开放阅读框（ORFs），编码150-200种蛋白质，其中约50种为结构蛋白［16]，主要结构蛋白有pp220、pp62、p72、p54、p22和CD2v蛋白等。ASFV粒子由病毒类核、内核芯壳、内囊膜、衣壳和外囊膜中由内向外组装而成［16]。结构蛋白作为病毒粒子的主要成分，在ASFV吸附、侵入和复制等感染过程中起作用［16-17]。因此，本文综述了ASFV结构蛋白在病毒感染中的作用，以期为ASFV结构蛋白的进一步研究提供参考。

1 内核芯壳蛋白

1.1 pp220和pp62蛋白

ASFV粒子直径为170-190 nm，是由病毒类核、内核芯壳、内囊膜、衣壳和外囊膜组成复杂的多层结构，核心结构直径为70-100 nm，包括病毒基因组、编码酶和被组装成病毒颗粒的蛋白质［16]。pp220和pp62蛋白为ASFV多聚蛋白前体，分别由CP2475L和CP530R基因编码，属于病毒感染过程中的晚期蛋白质。pp220蛋白含有多个蛋白酶水解靶基序，在Gly-Gly-X（任意）氨基酸序列水解位点，病毒编码的SUMO样S273R蛋白酶将pp220水解为成熟的病毒粒子蛋白p150、p37、p14和p34。因此，成熟的病毒粒子中不含pp220蛋白。按照相似的机理，pp62被水解为p35和p15蛋白［17]，S273R蛋白酶作为ASFV编码蛋白，也是病毒粒子内核芯壳蛋白之一［18-19]。多聚蛋白水解产物主要位于病毒粒子内核芯壳，约占病毒蛋白总量的30%，是内核芯壳的主要成分，pp220、pp62的水解与病毒粒子的组装是同时进行，该类蛋白的水解产物在病毒衣壳的组装过程中起关键作用［20-21]。有学者研究发现，病毒颗粒主要聚集在靠近细胞核的离散细胞质区域，该区域又被称为“病毒加工厂”，pp220蛋白则位于“病毒加工厂”之中［22]。有学者进一步研究发现，多聚蛋白pp220和pp62的加工需要病毒衣壳蛋白p72的表达，当p72表达受阻时，未加工的多聚蛋白pp220和pp62组装成异常的拉链样结构，该结构由细长的膜结合蛋白组成。此外，pp220和pp62在COS细胞中共表达时，该两种蛋白相互作用形成拉链样结构，pp220的表达则为pp62的加工奠定了基础［19]。因此，pp220和pp62水解为p150、p37、p14、p34、p35和p15蛋白成为病毒颗粒成熟的重要标志［23-24]，当pp220和pp62蛋白的水解受阻，组装的病毒颗粒则缺少内核芯壳，或者组装的病毒粒子不具有感染性［21-22]。

1.2 pp220和pp62蛋白水解产物

p37蛋白作为病毒内核芯壳的组分之一，是ASFV编码的第一个细胞核-细胞质骨架穿梭蛋白，具有输出和输入活性［25]。p37是pp220的水解产物，并与SUMO-1家族的蛋白酶具有较高的氨基酸序列相似性。通过对ASFV感染的细胞中p37进行定位，发现在病毒感染的早期，p37存在于细胞核的多个不同区域；而在感染后期，其仅存在于细胞质［26]。有学者研究发现，p37蛋白N-末端和C-末端区域主动从细胞核转运到细胞质，CRM1依赖性和CRM1非依赖性核转运途径介导p37核酸转运途径，p37蛋白中疏水性氨基酸对上述3种核转运信号功能至关重要［27]。这些研究表明，p37核酸转运途径对整个ASFV复制周期起着重要作用［26]。

p34蛋白作为重要的结构蛋白，有学者研究发现，p34蛋白受胰蛋白酶的保护。同时，可从胞质溶胶和膜组分中回收被错误加工的p34蛋白［21]。p34和p150蛋白膜相关组分可组装成病毒基质结构，大多数被错误加工的p150亦可从胞质溶胶之中回收，而p150的正确加工产物则被选择性地聚集到内囊膜［23]。p35和p15蛋白主要存在于内核芯壳，其基质样结构域位于含有DNA的类核和内囊膜之间，p35、p15蛋白和pp220水解产物在病毒粒子中以等分子量形式存在［18]。p14蛋白作为pp220的又一水解产物，参与抑制病毒DNA的复制，属于早期病毒蛋白。采用免疫荧光技术发现，该蛋白存在于被ASFV感染细胞的胞质膜，p14特异性抗体介导ASFV感染细胞的补体依赖性细胞溶解和抗体依赖性细胞毒性［28]。

有学者采用蛋白质组学分析技术对pp220和pp62蛋白成熟产物进行预测，发现两种从未检测到的小蛋白p8和p5［16]。p8蛋白是含有67个氨基酸序列的成熟蛋白，该蛋白由病毒pS273R蛋白酶在pp62蛋白Gly-Gly-X（任意）序列处切割水解而成。在第158-159氨基酸位点（GGG位点），pp62蛋白被水解切割为p15蛋白和中间前体（pp46蛋白）；在第463-464氨基酸位点（GGR位点），进一步水解切割为成熟的p35和p8蛋白。p35和p15蛋白易被其特异性抗体检测，但是通过免疫印迹技术发现，pp46中间前体蛋白诱导产生的p8抗体不能检测p8蛋白，其原理尚不清楚［16，29-30]。p5蛋白为含有43个氨基酸序列的成熟蛋白，在pp220蛋白第44-45氨基酸位点（GGG位点）水解切割而成。p5蛋白与p8蛋白相比，其蛋白小，免疫原性低，可快速降解，不易被检测［16，29-30]。有学者采用质谱（MS）分析技术进一步证实了p5和p8蛋白是病毒颗粒的结构组分［16]。总之，pp220、pp62及其水解加工产物在病毒的组装和感染过程中具有重要的功能。

2 内囊膜蛋白

2.1 p54蛋白

ASFV通过受体介导的胞吞机制进入靶细胞，利用囊膜和内吞泡膜的融合机制将病毒释放到细胞浆。p54蛋白由E183L基因编码，含有跨膜结构域和Gly-Gly-X氨基酸基序，以及多种ASFV结构蛋白的加工识别序列，位于病毒颗粒的内囊膜，是ASFV非常重要的抗原蛋白［31]。有学者制备了一种具有感染性的重组ASFV，确定感染细胞内病毒的运动轨迹和速度，从而将“病毒加工厂”的形成动态实现可视化［31]。采用转染细胞瞬时表达p54蛋白，发现该蛋白主要存在于转染细胞内质网膜。当p54蛋白合成受阻，则病毒粒子的形成受抑制。这表明，在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜时，p54蛋白扮演重要角色［32]。在ASFV感染的早期阶段，p54可以激活caspase 3，进而诱导细胞凋亡，这是首次报道ASFV蛋白可以诱导细胞凋亡［33]。

在病毒感染期间，p54直接结合到动力蛋白C-末端的轻链8（LC8），进而与微管动力蛋白相互作用［34]。采用核磁共振（NMR）技术发现，p54和突触后支架蛋白是动力蛋白轻链（DYNLL1）的两个靶标，这两种蛋白与DYNLL1直接相互作用，同时谷氨酰胺对其结合起着重要作用，并且这些蛋白序列都含有GIQVD和KXTQT基序［35-36]。采用减毒毒株免疫接种动物，发现p54在诱导特异性抗体中起重要作用，p54抗体可以抑制ASFV的吸附［31，44]。因此，在杆状病毒和大肠杆菌系统中表达的p54常被用于ASFV的血清学诊断［37-38]。曹琛福等［39]采用单克隆抗体对p54蛋白抗原表位进行鉴定，发现第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸为p54蛋白抗原位点。p54和p30蛋白作为与ASFV侵入宿主细胞密切相关的结构蛋白，其在病毒感染过程中具有相似的作用。与此同时，p54和p30作为抗原蛋白，可联合用于ASFV酶联免疫吸附试验（ELISA）方法的研发，提高检测方法的灵敏度［38-40]。

2.2 pE248R蛋白及其他内囊膜蛋白

pE248R蛋白是由E248R基因编码的ASFV晚期结构蛋白，是重要的内囊膜蛋白，参与蛋白分子中二硫键的形成。在病毒感染过程中，该蛋白被酰基化处理，并与病毒粒子内囊膜相连［41]。有学者发现，pE248R蛋白的缺失不影响病毒的吸附和内化，但抑制病毒粒子在宿主细胞中复制，以及病毒基因的早期和晚期表达。因此，pE248R蛋白缺陷的诱导型重组ASFV内囊膜与内体膜不发生融合作用，抑制其向细胞质核心区域转运［42]。pE248R和pE199L蛋白与痘病毒侵入/融合复合体具有很高的序列相似性，这表明该蛋白与ASFV融合机制有着密切联系［42-43]。采用免疫电子显微镜发现，pE248R、p17、p12和pH108R蛋白位于病毒内囊膜前体和“病毒加工厂”内二十面体颗粒，而非细胞表面。p17和pE183L蛋白是病毒粒子组装必需蛋白，而pE248R、p12和pE199L蛋白则与病毒侵入密切相关［20，41，44-45]。总之，在 ASFV 侵入宿主细胞后，pE248R蛋白对病毒基因的表达起重要作用。

p17蛋白作为ASFV重要的内囊膜蛋白，是病毒内囊膜上的跨膜蛋白，该蛋白可促进病毒膜前体进一步组装为二十面体中间体，以及增强病毒活力。当p17表达受阻，将抑制pp220和pp62蛋白的水解［45]。p12蛋白作为又一内囊膜蛋白，由O61R基因编码，参与病毒吸附，但是其吸附作用机制仍需进一步研究［46]。p22蛋白由KP177L基因编码，位于病毒颗粒外部，可被非离子去污剂从病毒颗粒表面上溶解处理。有学者采用冷冻切片免疫金标记技术，确定p22蛋白的亚病毒定位［47]。J5R蛋白，又名pH108R蛋白，由H108R基因编码，111个氨基酸组成，属于ASFV感染晚期表达蛋白［44]。该蛋白N-末端含有跨膜结构域，参与免疫应答反应，在病毒复制和形态发生等方面起重要作用［48]。

表1 ASFV结构蛋白的作用

3 衣壳蛋白

3.1 p72蛋白

p72蛋白由B646L（VP72）基因编码，是ASFV主要衣壳蛋白，是病毒二十面体衣壳的主要成分，具有高度抗原性和免疫原性。在病毒感染的晚期阶段，p72与其他相关蛋白的表达，以及形成病毒衣壳都紧密相关［16]。在病毒颗粒形成初期，p72在细胞质中富集，并与内质网膜结合，在内质网膜凸出的表面上形成病毒颗粒衣壳，在凹进的表面上形成内核芯壳［16，49]。p72参与ASFV的吸附和侵入过程，该蛋白的表达常作为病毒复制的标志［49-51]。p72抗体可阻断病毒与巨噬细胞的结合，但是其在抗体介导的免疫保护中不起决定性作用，这或许是目前尚无有效ASF疫苗的重要原因之一［40]。有学者采用针对p72和A151R基因的小干扰RNA（siRNA）技术来控制ASFV的体外复制，研究结果发现，靶向基因p72的siRNA可以降低病毒的复制，以及信使RNA（mRNA）水平［52]。将来自不同地区的ASFV毒株p72编码基因序列进行分析发现，p72基因在不同分离株中具有高度的保守性［53]。这表明，p72蛋白有较稳定的抗原性，为ASFV抗原研究提供了良好的靶蛋白［54-57]。有学者研究发现p72蛋白N端第11-18位、第26-48位、第73-82位、第136-150位、第159-174位、第181-189位、第191-210位、第247-276位、第279-295位、第313-323位和第382-392位氨基酸为p72蛋白的抗原位点［58]。

3.2 其他衣壳蛋白

p14.5蛋白，又称pE120R蛋白，是病毒衣壳蛋白之一，是DNA结合蛋白，参与抑制病毒DNA复制，是病毒粒子从“病毒加工厂”转移到胞质膜过程中的必需蛋白质。该蛋白由E120R基因编码，参与病毒粒子的胞内运输，其在病毒内核芯壳和衣壳的形成过程中起着重要作用［59]。有学者采用二维凝胶电泳（2DE）和MS技术发现，在病毒感染期间，p14.5蛋白N-末端丙氨酸（Ala）残基被乙酰化处理。与正常表达条件下比较，当pE120R蛋白表达受阻时，胞内病毒滴度未受影响，但胞外病毒滴度比对照组低100倍［59-60]。p49蛋白由B438L基因编码，属于ASFV感染晚期表达的病毒衣壳蛋白，是形成具有感染性病毒粒子的必需结构蛋白，由438个氨基酸组成，存在于“病毒加工厂”［61]。该蛋白缺乏时，组装的病毒粒子不呈二十面体对称结构，而呈异常的管状结构。在病毒感染期间，pB438L蛋白与膜结合，表现为完整的膜蛋白［61-62]。

4 外囊膜蛋白

CD2v蛋白，又称pEP402R蛋白，是一种糖蛋白，类似于T淋巴细胞表面的黏附受体CD2，由信号肽、跨膜域以及147个氨基酸的胞质尾组成。在ASFV感染期间，调节性反式高尔基体网络（TGN）蛋白复合物AP-1作为CD2v蛋白的靶标。CD2v蛋白主要在T细胞和NK细胞上表达，采用共聚焦显微技术发现，大部分表达的CD2v蛋白主要位于细胞质“病毒加工厂”周围区域，而非细胞表面［63]。在缺乏细胞外配体时，绝大多数的CD2v蛋白主要位于细胞核周膜腔区域［64]。在感染后期，红细胞吸附现象表明感染细胞中CD2v蛋白得到表达。在内质网或高尔基体中，CD2v蛋白可被切割成N-末端糖基化和C-末端非糖基化两种形式。与此同时，在感染细胞中，这两种切割形式可与CD2v完整蛋白同时存在［63]。CD2v蛋白参与细胞间黏附、毒力增强和免疫应答调节过程，对ASFV的组织趋向性、免疫逃避等一系列致病机理起着重要作用［65]。CD2v蛋白可破坏淋巴细胞功能，并且该蛋白的表达与ASFV在家猪之间的传播有着密切联系。有学者采用酵母双杂交系统发现，CD2v蛋白的细胞质尾部可与细胞质接头蛋白SH3P7相互作用，而SH3P7蛋白质参与多种细胞功能调节，如囊泡转运和信号转导［64]。有学者提出，将CD2v蛋白的细胞质区域作为新的遗传标记，这一特性可用于分析来自不同区域的ASFV毒株，并追踪病毒的传播轨迹，最终建立基于蛋白质细胞外部分的全球毒株血清学分类体系［66-67]，研究ASFV毒株在自然界中的多样性，并为疫苗研发奠定坚实的基础［66-68]。p12蛋白C-末端区域富含半胱氨酸的结构域，参与病毒的吸附，在病毒感染的晚期，由O61R基因表达，有学者通过免疫电子显微镜发现，该蛋白位于病毒粒子层，细胞表面的膜蛋白是ASFV的受体。在机体外，p12蛋白可阻断ASFV侵入宿主细胞，但p12蛋白抗体被动接种机体内，其不能中和ASFV，进而达到被动保护机体的作用［69]。

5 总结与展望

ASF作为一种急性、烈性、出血性的猪传染性疫病，给疫情发生国家（地区）的养猪业带来严重的经济损失。我国作为对外贸易强国和养猪业大国，一旦ASF在我国完全定殖，将会给我国的养猪业带来严重损失，ASF防控形势不容乐观［70-71]。ASFV基因型较多，种类庞大，免疫逃逸机制复杂多样。ASFV编码蛋白的数量众多，其中结构蛋白作为病毒颗粒的主要组分，参与病毒的吸附、进入和复制等感染阶段。虽然相关蛋白的研究不断得到深入，但仍有大量编码蛋白的功能，以及与宿主细胞的作用机制尚不清楚，这系列问题必将成为ASFV研究的热点。国内学者先后对ASFV的致病机理、分子流行病学、诊断方法、疫苗研究等方面进行了综述［72-75]，对ASFV的致病机制有了一定的认识，但仍有不足之处。因此，本文通过对参与ASFV感染的结构蛋白，以及这些蛋白和宿主细胞之间相互作用的机制进行综述，进一步阐释ASFV结构蛋白在感染过程中的作用，为我国的ASF防控提供理论参考。