传统发酵豆酱的微生物群落结构和游离氨基酸组成及其相关性分析

张慧林，王永胜，李冲伟,*

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080；3.黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080）

豆酱是以大豆为主要原料，利用微生物经过自然发酵制成的半流动状态的发酵食品[1]。不同发酵方法生产的豆酱产品质量不同。Kim等[2]通过使用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）研究了10 个豆酱样品的微生物多样性，结果发现不同样本的群落结构存在一定差异。Zhu Linjiang等[3]通过研究蚕豆酱在传统发酵过程中的微生物群落，揭示了微生物群落结构对发酵过程中风味物质产生的影响。因此，分析不同地区传统豆酱的微生物多样性对于了解产品质量至关重要。Namgung等[4]通过主成分分析发现，氨基酸可能与口感、风味、营养和生理活性有关。康旭等[5]对豆酱中氨基酸与挥发性物质的关系分析表明，氨基酸种类与豆酱风味物质有一定的相关性，酸性氨基酸会增加豆酱的鲜味，中性氨基酸可能产生丁香味的风味物质，碱性氨基酸对风味影响较小。可见，氨基酸对豆酱产品质量起着重要作用。基于以上微生物群落结构与游离氨基酸对豆酱质量的影响，本实验采用高通量测序技术和氨基酸分析技术研究不同地区豆酱产品的质量，采用偏最小二乘回归（partial least-squares regression，PLSR）模型分析豆酱微生物多样性和游离氨基酸组成的相关性，寻找几种不同豆酱产品质量差异的原因，并为将来企业提高产品质量提供理论依据。本实验具体分析得到豆酱中游离氨基酸的组成以及豆酱中微生物结构组成的关系，并明确东北地区质量较好的豆酱产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵豆酱样品，从黑龙江省黑河、黑龙江省宝泉岭、黑龙江省桦南和吉林省长春4 个地区采集新鲜的传统发酵豆酱样品（分别为HeiH、BaoQL、HuaN、ChangC）。采集的样品经无菌容器密封后低温保藏运输，在实验室-80 ℃保存。

DNA提取试剂盒、PCR扩增的全套试剂及扩增引物生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GeneAmp PCR System 9700 郑州杜甫仪器厂；Power Pac Universal水平电泳仪 北京普析通用仪器有限责任公司；Gel DOCXR凝胶成像系统、日立L8800氨基酸自动分析仪 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法评价豆酱样品的质量

QDA是一种以描述性分析为主的对样品进行感官评定的方法，利用多元统计方法分析获得数据，对样品进行定性和定量相结合的分析。具体分析过程为：首先挑选评定员组成定量描述分析小组，提出并挑选能反映样品感官特性的描述词汇，然后采用线性标度对其进行评价打分，打分结束后进行统计分析，用雷达图直观表示对测定样品的质量评价[6]。本研究挑选10 名评定员，从色泽、香气、滋味和体态4 个方面对不同地区的发酵豆酱样品进行质量评价，评价结果采用QDA图表示[7-9]。

1.3.2 发酵豆酱中微生物多样性的测定

提取每个样品总DNA，检验合格后，利用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对细菌的16S rDNA的V3-V4区域扩增。利用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）对真菌ITS的ITS1区域扩增。PCR扩增及测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司。

1.3.3 发酵豆酱中氨基酸的种类及含量测定

称取1 g豆酱样品，加10 mL 6 mol/L盐酸溶液于水解管中，混匀，充氮并迅速封口，110 ℃水解22～24 h，冷却后过滤，滤液真空浓缩至干，重复1～2 次。加入5 mL pH 2.2柠檬酸钠缓冲液，滤膜过滤后利用氨基酸自动分析仪测定[10-11]。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件，对样品中氨基酸进行主成分分析和综合性评价[12]。用Simca14.1软件以PLSR建立模型，分析微生物菌群结构与游离氨基酸之间的相关性[13]。

2 结果与分析

2.1 发酵豆酱产品质量评价

表1 豆酱感官特性评分与微生物OTU数Table 1 Sensory evaluation and microbial OTU number of fermented soybean paste

图1 4 种发酵豆酱的QDA图Fig. 1 QDA diagram of 4 fermented soybean pastes

由表1和图1可知，4 种豆酱在4 个感官特性强度上差异较大，尤其样品BaoQL在4 个感官特性强度上都较强，而样品HeiH在香气、滋味、体态感官特性强度上都较弱。BaoQL综合评分最高，HeiH综合评分最低。

2.2 样品序列OTU分析

采用FLASH、Trimmomatic软件处理原始数据[14]，将获得的所有序列进行OTU分类。由表1可知，4 份样品的细菌OTU总数为238，平均数为60，最大值为70，最小值为47。4 份样品的真菌OTU总数为254，平均数为64，最大值为70，最小值为53，由此可以看出，4 份样品中真菌的OTU数比细菌的OTU数大，真菌的物种丰富度较大。

图2 细菌（a）和真菌（b）的Rank-Abundance曲线图Fig. 2 Rank-Abundance curves of bacteria (a) and fungi (b)

在Rank-Abundance曲线中，OTU等级代表系统群落物种的丰度，OTU等级越高，表示系统里物种越丰富。OTU曲线越平滑，表示系统里物种越均匀[15]。由图2a可知，BaoQL的细菌物种丰度最高，物种数量分布也最均匀，ChangC的次之；由图2b可知，HeiH的真菌物种丰度最高，BaoQL次之；真菌物种数量分布上，BaoQL更加均匀，这可能与两个地区的纬度差异和气候不同有关。

2.3 Alpha多样性分析

表2 豆酱Alpha多样性分析Table 2 Alpha diversity index of bacteria and fungi in fermented soybean pastes

OTU分析后，分别计算各Alpha多样性指数[16]。由表2可知，4 份豆酱样品细菌的Chao l指数平均值为75.19，ACE指数平均值为75.00，Shannon指数平均值为1.58。4 份豆酱样品真菌的Chao l指数平均值为26，ACE指数平均值为30.60，Shannon指数平均值为0.83。从Chao l和ACE指数可以看出，豆酱样品的细菌菌群丰度高于真菌菌群丰度。从Shannon指数可以看出，豆酱样品的细菌物种均匀度高于真菌物种均匀度。因此，传统豆酱中细菌菌群多样性更加丰富[17]。

2.4 豆酱样品菌群结构组成分析

图3 属水平上豆酱细菌丰度分析Fig. 3 Relative abundance of bacteria from fermented soybean paste samples at the genus level

4 份豆酱样品中共检测到21 种细菌，如图3所示，包括四联球菌（Tetragenococcus）、乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、芽孢杆菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、明串珠菌（Leuconostoc）、假单胞菌（Pseudogracilibacillus）等。4 份豆酱样品的细菌组成差异较大，样品HuaN和HeiH的优势细菌为Tetragenococcus（54.71%～84.52%）；样品ChangC的优势细菌为Lactobacillus（83.86%）；样品BaoQL的优势细菌为Weissella（32.88%）。

图4 属水平上酱醅真菌丰度分析Fig. 4 Relative abundance of fungi from soybean paste samples at the genus level

4 份豆酱样品共检测到11 种真菌，如图4所示，包括青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Aspergillus）、unclassified-k-Fungi、假丝酵母（Candida）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）、鲁氏酵母菌（Zygosaccharomyces）、毕赤酵母属（Millerozyma）等。4 份豆酱样品的真菌组成差异也较大，样品HuaN和HeiH的优势真菌为Penicillium（78.28%～89.90%）；样品ChangC的优势真菌为unclassified-k-Fungi（67.37%）；样品BaoQL的优势真菌为Aspergillus（94.01%）。

2.5 豆酱样品中游离氨基酸组成分析

2.5.1 豆酱样品中游离氨基酸的测定

由表3可知，4 种豆酱都含有17 种游离氨基酸，包括甜味氨基酸、苦味氨基酸和无味氨基酸，其中游离氨基酸总量最多的为BaoQL（（9.482±0.044）mg/g），最少的为HeiH（（3.685±0.031）mg/g）。检测出人体必需氨基酸7 种，BaoQL中7 种氨基酸含量均高于其他样品。

表3 豆酱样品中各游离氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents in fermented soybean paste samples mg/g

2.5.2 豆酱样品主成分分析与豆酱质量评价

表4 豆酱各游离氨基酸的主成分特征值及其累计变异百分比Table 4 Characteristic values and cumulative percentage variations of principal components

将各样品游离氨基酸值输入计算机，采用SPSS 20.0软件进行主成分分析[18]，结果如表4所示，2 个主成分的特征值均大于1，且累计贡献率达到97.823%，说明前2 个主成分基本包含了全部游离氨基酸具有的信息[19]，因此可以将原来的17 种氨基酸转化为2 个主成分。从图5可知，第1主成分与其中16 种氨基酸含量呈正相关，与半胱氨酸呈负相关。第2主成分与半胱氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸含量呈正相关，与酪氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸含量呈负相关。

图5 因子载荷图Fig. 5 PCA factor loading plot

表5 豆酱的游离氨基酸综合评价指数Table 5 Comprehensive evaluation index of fermented soybean paste samples

利用综合评价指标F1、F2替代原有的17 个氨基酸指标进行综合分析，以每个主成分所对应的特征值的方差贡献率建立综合评价模型[20]，即F=0.849 0F1+0.129 3F2，其中F为综合得分，如表5所示，BaoQL的游离氨基酸综合评分最高，ChangC次之，HeiH综合评分最低。

2.6 豆酱样品中微生物群落结构与游离氨基酸相关性分析

利用PLSR模型对豆酱样品中微生物群落结构与游离氨基酸之间的相关性进行分析[21]，数据所建PLSR模型对X与Y相关性的解释能力R2cum为0.807，且该模型对新数据集的预测能力Qc2um为0.539，这说明该模型满足分析的需要。

图6 与游离氨基酸相关的重要微生物分析Fig. 6 Analysis of important microbes related to free amino acids

通过VIPpred表示微生物组成与游离氨基酸的相关性。从图6可知，豆酱中33 个微生物的VIPpred在0.42～1.40之间，与游离氨基酸相关性最大的细菌为Weissella，VIPpred值为1.40；与游离氨基酸相关性最大的真菌为Millerozyma和Aspergillus， VIPpred值均为1.40。Weissella、Millerozyma和Aspergillus对豆酱的氨基酸组成和含量影响最大；细菌的VIPpred值大于真菌，说明细菌群落对游离氨基酸的组成和含量起主导作用。BaoQL豆酱的微生物群落结构中，优势细菌为Weissella，优势真菌为Aspergillus，而这两类菌对氨基酸的生成均起着重要作用，这也解释了BaoQL豆酱产品质量好的关键原因。

3 结 论

QDA可知，4 种发酵豆酱中，黑龙江省宝泉岭的豆酱产品质量最优。黑龙江省宝泉岭豆酱中游离氨基酸种类和总质量浓度最高，因此，游离氨基酸种类和总质量浓度对产品质量的影响至关重要。这与武俊瑞等[22]在豆酱中氨基酸的种类和数量决定豆酱品质中的结论和Lin Hongbin等[23]得出氨基酸有望用于评价和代表郫县蚕豆酱的风味品质的结论一致。

豆酱中游离氨基酸的组成和含量与发酵过程中微生物群落结构有很大关系，细菌中Weissella对游离氨基酸的种类和含量影响最大，真菌中Millerozyma和Aspergillus对游离氨基酸的种类和含量影响最大；细菌菌群对游离氨基酸种类和含量的影响显著高于真菌菌群。黑龙江省宝泉岭豆酱样品的质量明显好于其他3 个样品，主要因为黑龙江省宝泉岭豆酱中含有上述几种优势菌群，导致氨基酸种类和含量均高于其他样品，这与Kim等[24]研究的韩国发酵大豆酱微生物群落与豆酱的感官属性密切相关和Li Zhihua等[25]研究的中国传统红辣椒豆瓣酱中细菌群落和挥发性化合物之间高度协变关系的结论一致。

微生物发酵产品质量与其微生物多样性的关系，近年来已经引起国内外研究者的高度关注。Lee等[26]通过对豆酱的微生物多样性与代谢组学进行相关性分析表明，鲁氏接合酵母和四联球菌属与氨基酸代谢、曲霉属与糖代谢、芽孢杆菌属与脂肪酸代谢都有显著相关。Li Zhihua等[27]分别通过对豆酱中的细菌多样性和代谢产物进行相关性分析，得到假单胞菌与含氮代谢物显著相关，链球菌属与含碳代谢物等显著相关。因此，还需要进一步分析豆酱中微生物多样性与其他代谢产物之间的相互关系，为发酵豆酱产品质量提供更全面的理论依据。