单宁酸对鸢乌贼肌原纤维蛋白膜性能的影响

仇超颖，荣 婧，胡 晓，杨贤庆,*，李来好

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300；2.暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东 广州 510632；3.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

随着人们对环境问题关注度的日益提高，可降解食品包装膜的开发受到了研究者的高度重视。蛋白质为典型的天然食品聚合物，其来源广泛，产量高并具有独特的结构，已广泛应用于可食用包装膜材料的制备研究[1-2]。低值水产蛋白是制备可食用蛋白膜的良好原料，肌原纤维蛋白含有丰富的巯基，有利于形成二硫键而赋予产品良好的凝胶特性[3]。鸢乌贼（Symplectoteuthis oualaniensis）属于柔鱼科、鸢乌贼属，是广泛分布于我国南海海域的一种大型可食用软体动物[4]。鸢乌贼体内含有低脂高蛋白，是一种营养价值较高的海产品。但由于鸢乌贼肌肉组织致密，肉质较硬等口感缺陷导致其市场占有量较低。国内目前多将鸢乌贼粗加工成鱿鱼丝，其产品加工层次较低。因此开展鸢乌贼资源深加工利用，高效高值化利用蛋白对于扩大鸢乌贼的市场具有重要意义[5]。

水产蛋白具有较高的透光性及机械性能，但大多数耐水蒸气能力较低[2]。目前，国内外学者多利用肌肉蛋白制备蛋白膜，研究其加工工艺以及功能特性。而采用酸碱提取等电点沉淀蛋白方法制备蛋白膜的工艺研究相对较少[6]。采用醛类物质交联方法以改善蛋白膜机械性能，此类方法有一定毒性[7]。采用蛋白-多糖接枝，或使用酚类物质作交联剂的方法不会产生毒性及污染，目前对于这类改性蛋白的应用研究相对较少。葡聚糖是一种高分子链中性多糖，具有良好的水溶性及稳定性[8]，对鸢乌贼蛋白接枝能够改善蛋白膜的功能特性。此外，糖分子可增大蛋白的空间位阻形成致密的空间网状结构，进而维持膜体的稳定性[9]。单宁酸是一类广泛存在于蔬菜水果中具有多个酚羟基等活性集团的高分子化合物，与蛋白质结合能力较强[10]，碱性条件下氧化多酚羟基可与蛋白的侧链氨基发生交联作用，酸性和中性条件时则主要发生非共价相互作用[11-12]。同时由于单宁酸具有较好的抗氧化性，添加此类物质可将食用膜应用在高油脂食品包装领域[2]。

本研究采用酸、碱法分别提取鸢乌贼分离蛋白，并对鸢乌贼肌原纤维蛋白进行葡聚糖接枝改性，研究单宁酸对以上3 种蛋白膜性质的影响，为制备鸢乌贼蛋白可食用包装材料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸢乌贼购于湛江水产市场。单宁酸、葡聚糖（分子质量67 000 Da）、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、亮氨酸（99%）、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5-dithio-2-nitrobenzoate，DTNB）、三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）、牛血清蛋白 美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T50型均质机 德国IKA公司；3K30型高速冷冻离心机 德国Sigma公司；ALPHA1-4冷冻干燥机德国Christ公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒公司；UV2550紫外分光光度计、IRAffinity-1红外光谱仪 日本岛津公司；SP2258型荧光光度仪 美国Ropera Scientific公司；DK-S24型恒温水浴锅 上海森信实验仪器厂有限公司；1530VP扫描电镜 德国LEO公司。

1.3 方法

1.3.1 酸、碱法提取鸢乌贼蛋白

取低温解冻并绞碎的乌贼肉，加冰蒸馏水（料液比1∶6（g/mL））10 000 r/min均质1 min，分别用2 mol/L HCl溶液和2 mol/L NaOH溶液调pH值至3和11，低速搅拌30 min后离心（10 000×g、20 min、4 ℃），取上清液调pH 5.0，离心（10 000×g、20 min、4 ℃），沉淀即得酸提和碱提鸢乌贼蛋白。

1.3.2 糖基化肌原纤维蛋白的制备

参照Saeki[13]的方法。取绞碎的乌贼肉置于3 倍原料肉体积的50 mmol/L NaCl、质量分数0.5%的Triton X-100溶液中漂洗10 min，倒掉悬浮物。漂洗过的肉置于8 倍原料体积的上述溶液，经均质机20 000 r/min均质2 min后纱布过滤，所得滤液8 000×g离心10 min，取沉淀用50 mmol/L NaCl溶液漂洗并离心，重复3 次，尼龙布过滤，沉淀即为肌原纤维蛋白，上述实验步骤通过冰水浴控制在低于8 ℃进行。肌原纤维蛋白溶于50 mmol/L的NaCl溶液中，调溶液中蛋白质量浓度5.0 mg/mL与葡聚糖定量（质量比1∶1）混合均匀，之后冷冻干燥，取冻干粉在相对湿度35%、温度50 ℃条件下干热反应12 h，之后溶解再次冻干得到糖基化肌原纤维蛋白。

1.3.3 蛋白膜的制备

参考Shiku等[14]的方法。取上述酸、碱提取及糖基化肌原纤维蛋白样品溶于去离子水中，使蛋白质量浓度为2 g/100 mL，加入糖基化肌原纤维蛋白质量50%的甘油作为增塑剂，3 000 r/min均质1 min，碱法提取蛋白溶液及糖基化改性肌原纤维蛋白溶液调节pH 11，酸法提取蛋白溶液调节pH 3，分别添加糖基化肌原纤维蛋白质量0%、1%、2%、3%的单宁酸至溶液中，混合液于室温搅拌30 min，70 ℃保温30 min，迅速降温，低速离心脱气。准确量取适量成膜液，倒入聚四氟乙烯小圆盘中，于60 ℃烘箱中干燥3 h成膜。之后在装有饱和NaBr溶液的干燥器中（56%、20 ℃）平衡48 h后待测。

1.3.4 自由氨基含量测定

参考Lertittikul等[15]方法。取蛋白溶液（125 μL）稀释5 倍后与2.0 mL 2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 8.2）混合，之后加入1.0 mL 0.01% TNBS溶液混合均匀后在50 ℃暗处反应30 min，加入2.0 mL 0.1 mol/L亚硫酸钠终止反应。空白采用蒸馏水代替0.01% TNBS添加于缓冲液中，420 nm波长处测定吸光度，由L-亮氨酸标准曲线计算自由氨基浓度（mmol/L）。

1.3.5 巯基含量测定

参考Beveridge等[16]的方法。测定成膜液的总巯基含量。取1.0 mL样品成膜液，加入9 mL盐酸胍磷酸缓冲液（盐酸胍 6 mol/L、磷酸盐缓冲液0.1 mol/L、pH 8.0），取4 mL以上混合液加入质量分数0.1% 的DTNB溶液0.4 mL，置于水浴锅中45 ℃保温反应25 min，于412 nm波长处测定吸光度。巯基含量由摩尔吸光系数13 600 L/（mol·cm）计算，以每克蛋白质中所含的物质的量表示。

1.3.6 蛋白膜厚度测定

在膜材料上随机取5 个点，用千分尺测量膜的厚度，取平均值，精确至0.01 mm。

1.3.7 蛋白膜机械性能测定

选择厚度均匀，无气泡的膜材料裁切成20 mm×80 mm的长条，将膜固定于质构仪测试部件两端，初始距离30 mm、速率30 mm/min对膜拉伸直至断裂，记录拉伸过程中的最大应力及膜断裂时的拉伸长度。拉伸强度表示为膜材料拉伸过程中的最大应力与膜的横截面积之比，断裂伸长率表示为膜材料断裂时膜长度与测试部件初始距离之比。拉伸强度和断裂伸长率计算公式如下：

式中：TS为拉伸强度/MPa；F为膜拉伸过程中的最大应力/N；S为膜的横截面积/m2。

式中：EAB为断裂伸长率/%；L为膜断裂时的长度/mm；L0为膜拉伸前的原始长度/mm。

1.3.8 蛋白膜色度的测定

采用色差仪对蛋白膜颜色进行测定（L*值（黑-白）、a*（红-绿）、b*（蓝-黄））。在膜材料上随机取5 个点测量，取平均值。

1.3.9 蛋白膜含水量及水溶性测定

将膜剪裁为20 mm×20 mm的正方形并称质量（m1），置于105 ℃恒温干燥箱中烘至质量恒定（m2）。将质量恒定后的干膜浸泡在水中，24 h之后，小心移走烧杯中的水，将浸泡后的膜置于105 ℃恒温干燥箱中烘至质量恒定（m3）。含水量和水溶性计算公式如下：

式中：MC为含水量/%；WS为水溶性/%；m1为膜材料的初始湿质量/g；m2为膜材料的初始干质量/g；m3为溶解后膜材料干质量/g。

1.3.10 膜材料水蒸气透过率的测定

根据文献[17]方法对膜材料水蒸气透过率进行测定。透湿杯直径为22 mm，深度为50 mm，向杯中注入一定量蒸馏水。将直径为50 mm的圆形膜材料，遮盖住透湿杯杯口，用石蜡将膜材料与杯口连接处密封，使瓶口与膜之间紧密结合，称取透湿杯质量。将透湿杯置于装有五氧化二磷的密闭干燥器内，干燥器内装有风扇，保持空气循环流动。测试装置置于25 ℃，每3 h将透湿杯取出并称质量，膜的水蒸气透过率计算公式如下：

式中：WVP为膜的水蒸气透过率/（g/（s·m·Pa））W为测量杯增质量/g；L为膜材料厚度/m；t为时间/s；s为膜材料的有效测试面积/m2；Δp为膜两侧水蒸气压差/Pa。

1.3.11 蛋白膜不透明指数测定

选择厚度均匀，无气泡的膜材料裁切成30 mm×9 mm的长条，将薄膜紧贴于比色皿的内壁上，于波长600 nm处测吸光度，使用空白比色皿作对照，不透明指数为吸光度与膜厚度的比值。

1.3.12 蛋白膜红外光谱分析

称取适量冻干的肌原纤维蛋白及糖基化反应12 h的产物与溴化钾研磨均匀（质量比1∶100），压成薄片，置于样品室，采用红外光谱仪全波段（500～4 000 cm-1）扫描。

1.3.13 蛋白膜微观结构表征

膜表面及截面微观结构采用扫描电镜分析，用双面胶将裁切好膜材料置于样品盘上观测。

1.4 数据处理

所有数据均测量3 次，采用SPSS 19.0和Origin pro 8对实验数据进行统计、分析，实验数值间以Duncan法（P＜0.05）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白成膜液自由氨基和巯基含量

图1 添加单宁酸对蛋白成膜液自由氨基（A）和巯基（B）含量的影响Fig. 1 Influence of tannic acid on free amino group (A) and total sulfhydryl content (B) of film-forming solutions

如图1A所示，糖基化蛋白的自由氨基含量显著低于酸提和碱提蛋白，表明糖基化过程中自由氨基与糖分子发生了接枝反应。酸提蛋白的自由氨基含量高于碱提蛋白，这可能是由于酸提过程中蛋白发生一定程度的降解，使部分自由氨基暴露。图1B中，碱提蛋白成膜液中巯基含量明显高于酸性及糖基化蛋白成膜液，可能是因为碱性条件导致蛋白质分子结构伸展，有助于增强蛋白质分子间的相互作用[6]。与对照组（0%）相比，当单宁酸添加量为1%～3%时，蛋白成膜液中巯基含量均显著降低（P＜0.05）。酚类化合物中的羟基易氧化为醌，与蛋白分子中的氨基或巯基发生相互作用，形成C—N或C—S键[18]。Prodpran等[19]发现鱼肉肌原纤维蛋白添加酚类物质巯基含量降低，与该实验研究结果一致。

2.2 蛋白膜色度、含水量、水溶性及外观

可食用膜的颜色会影响产品的外观和消费者的接受程度[20]。如表1所示，对照组蛋白膜接近于无色，添加单宁酸之后，3 种蛋白膜颜色均随单宁酸添加量的增加而增加，其中碱提及糖基化改性蛋白膜的b*值增加程度远高于酸提蛋白膜，主要是由于单宁酸分子中的酚羟基碱性条件下氧化为醌中间体，作为交联剂起到对蛋白分子的交联作用[21]。同时可以发现，酸提蛋白和碱提蛋白含水量差异不显著，单宁酸加入并未对二者形成的蛋白膜有显著影响，而糖基化蛋白膜含水量明显低于酸提和碱提蛋白膜，并且单宁酸显著降低了糖基化蛋白膜的含水量，这主要是由于糖基化蛋白由于葡聚糖分子的引入，渗透压增大，同时单宁酸增加了蛋白的交联和聚集，降低了蛋白与水分子的相互作用，导致蛋白膜的含水量显著降低。从表1还可发现，碱提蛋白膜水溶性略低于酸提蛋白膜，可能是因为碱性时蛋白质分子间的疏水相互作用或二硫键的交联作用更强，这也与其巯基含量变化（图1）一致。糖基化蛋白由于引入了亲水基团导致水溶性显著升高，更适合用做含有活性物质的包装材料，膜中活性物质易于释放，并且膜更容易降解。单宁酸加入显著降低了蛋白膜材料的水溶性，表明多单宁酸通过交联作用使蛋白聚集。此外，虽然不存在共价交联，酸性蛋白膜加入单宁酸后水溶性也显著下降，表明非共价反应如氢键或疏水相互作用同样会导致蛋白质水溶性的降低。

表1 添加单宁酸对蛋白膜色度、含水量及水溶性的影响Table 1 Influence of tannic acid on color parameters, moisture content and water solubility of protein-based films

图2 单宁酸添加量对蛋白膜外观的影响Fig. 2 Influence of different tannic acid concentration on film appearance

如图2所示，未添加单宁酸的蛋白膜均为均匀透明，加入单宁酸后碱性蛋白膜与糖基化蛋白膜颜色明显变黄，而糖基化蛋白在1%单宁酸存在时b*值增加程度较低，表明此时糖基化减弱了肌原纤维蛋白与氧化单宁酸之间的相互作用。

2.3 蛋白膜微观结构分析

图3 酸提、碱提、糖基化蛋白膜截面和表面微观结构图Fig. 3 Microstructure of film cross section and surface of acid-, alkaliextracted and glycosylated protein with addition of 1% TA

由图3可见，酸提、碱提及糖基化蛋白膜的截面图与表面均光滑无气泡。其中糖基化蛋白膜表面有少量裂纹，这可能是由葡聚糖与肌原纤维蛋白的相互作用以及糖基化蛋白膜含水量较低造成。添加单宁酸后，碱性及糖基化蛋白膜的截面及表面均变得粗糙不平，表明肌原纤维蛋白与氧化的单宁酸发生了交联作用导致聚集，但在酸性蛋白膜中这一现象并不明显。

2.4 蛋白膜机械强度测定结果

图4 添加单宁酸对蛋白膜机械强度的影响Fig. 4 Influence of tannic acid on mechanical properties of films

如图4所示，相比于酸提和碱提蛋白膜，糖基化蛋白膜的拉伸强度及断裂伸长率在0%～2%单宁酸添加量时较高。这与Zhang Huajiang等[22]的研究一致，说明糖分子与蛋白质相互作用，使得膜材料的结构更加均匀致密，膜的力学性能提高。同时，碱提蛋白膜的拉伸强度及断裂伸长率均高于酸性蛋白膜，这可能是由于碱性提取条件下蛋白聚集增强。添加单宁酸显著增加了蛋白膜的拉伸强度，而降低了蛋白膜的断裂伸长率（P＜0.05）。其中，添加1%的单宁酸的糖基化蛋白具有较高的膜拉伸强度和断裂伸长率，分别为1.26 MPa和118%，Rattaya等[23]曾对添加海藻提取物的鱼皮明胶蛋白膜进行研究，同样发现明胶蛋白膜的拉伸强度升高，断裂伸长率降低，与该实验结果一致。多酚与蛋白分子中的氨基和巯基交联反应，形成高分子共价聚合物，同时单宁酸具有稳定的六环结构，与蛋白交联阻碍了蛋白分子中键的自由旋转，增强蛋白质分子间紧密性，使得蛋白膜拉伸强度提高，但脆性的增加也使断裂伸长率降低[24]。

2.5 蛋白膜水蒸气透过率测定结果

图5 添加单宁酸对蛋白膜水蒸气透过率的影响Fig. 5 Influence of tannic acid on water vapor permeability of films

水蒸气透过率反映了食品和大气间水分交换能力，水蒸气透过率越低越利于食品保鲜[25]。由图5可知，糖基化蛋白膜的水蒸气透过率最低。虽然糖基化蛋白膜水溶性较高（表1），但蛋白膜基质致密性增强，因此降低了水分子透过蛋白膜材料的扩散速率。同时可以发现，单宁酸加入显著降低了膜的水蒸气透过率。这是由于酚类可通过氢键及共价键与蛋白质相互作用，形成更致密的膜基质[26]，减少了蛋白质与水分子的氢键结合，从图3结果也可知含单宁酸的蛋白膜粗糙度较高，膜材料结构更致密，因此减慢了水蒸气的透过性。Arfat等[27]研究也指出，膜材料中蛋白质分子间的相互作用越强，水分子透过膜材料的渗透性越低。

2.6 蛋白膜不透明指数测定结果

图6 添加单宁酸对蛋白膜不透明指数的影响Fig. 6 Influence of tannic acid on opacity index of films

如图6所示，碱提蛋白膜的不透明指数最高，酸提蛋白膜的透明度最高。主要是由于酸提蛋白膜及糖基化蛋白膜的交联程度低，而碱性条件下提取的蛋白质聚集程度高。添加单宁酸后，蛋白膜材料的不透明度显著增大，这与Blanco-Pascual等[6]的研究一致。透明度的差异与薄膜颜色有关，随着单宁酸添加量增加，膜颜色逐渐变黄，导致透明度下降。

2.7 蛋白膜红外光谱测定

图7 酸提、碱提及糖基化蛋白膜的红外光谱图Fig. 7 Infrared spectra of acid-, alkali-extracted and glycosylated protein- based films

由图7可知，所有膜材料均有3 个主要振动带：1 633 cm-1为酰胺I带，C＝O和H—N之间的氢键性质决定酰胺I带的振动频率；1 536 cm-1为酰胺II带，代表N—H弯曲振动和C—H伸缩振动；1 238 cm-1为酰胺III带，代表C—H和N—H振动，所有膜在1 036～1 039 cm-1范围内均有振动，为甘油—OH与蛋白间的相互作用。在3 280～3 300 cm-1范围为酰胺A基团振动带代表N—H与氢键振动。在2 926～29 28 cm-1范围为酰胺B基团振动带代表C—H和—NH2间的不规则伸缩振动[28]。

波长1 040 cm-1为葡聚糖CH2—OH基团中C—O的伸缩振动，979 cm-1和987 cm-1为C—C的振动吸收峰[29]。如图7所示，糖基化使蛋白红外光谱发生明显变化，其中在1 000～1 100 cm-1范围内的2 个吸收峰合并为1 个峰，表明葡聚糖分子接枝在了蛋白分子上。3 种蛋白膜中，酸提蛋白膜酰胺A带的波数最大（3 328 cm-1），而糖基化蛋白膜最低（3 282 cm-1），表明糖基化蛋白膜中蛋白分子间的相互作用最弱，而水、蛋白与增塑剂之间氢键作用较强[24]。酸性条件下蛋白在膜中分布较为均匀。而碱提蛋白膜和糖基化蛋白膜在碱性条件下蛋白分子发生聚集，且葡聚糖接枝引入更多氢键[30]。添加单宁酸后酰胺A带转移至较低波长处，蛋白质通过共价键及非共价键与氧化或未氧化的单宁酸反应，均促进了蛋白在膜网络结构中的交联。此外，酰胺II带代表N—H的弯曲振动，添加单宁酸后，3 种蛋白膜材料的酰胺II带均转移到较低波数，也证明了蛋白质基质与单宁酸之间发生了相互作用[31]。

3 结 论

本实验比较不同制取方式的鸢乌贼肌原纤维蛋白膜的性质，酸提、碱提及糖基化蛋白膜均具有较光滑平整的外观及较高的透明度，其中糖基化蛋白膜具有较低的水蒸气透过性和较高的机械强度，结构较为致密。单宁酸与蛋白产生交联作用显著增强了膜的拉伸强度，降低了水溶性和水蒸气透过率，但断裂伸长率略有下降，同时膜表面较为粗糙。红外光谱的波数移动也证明了单宁酸与蛋白分子的交联作用。综合考虑，糖基化改性同时添加1%的单宁酸在膜溶液中能够显著改善蛋白膜的机械性能和水蒸气透过率，蛋白膜具有较佳的综合性能。