新乡市大气细颗粒物中细菌种群多样性及分布特征

黄永超,李慧君,安 珍,徐光翠,范 威,单怡凡,姜 静,张丰泉,李海斌,吴 辉,吴卫东

(新乡医学院公共卫生学院，河南省国际联合实验室，河南 新乡 453003)

细颗粒物(particulate matter,PM2.5)极易被人体吸入并进入全身血液循环，对人体健康造成较大危害[1-2]。已有较多研究关注PM2.5化学组分对健康的影响[3-4]。细菌在近地面空气中普遍存在[5]，且PM2.5中的微生物具有引发组织炎症并传播人类、植物和家畜病原菌等危害[6]，也是反映环境空气质量的重要指标。王步英等[7]分析了北京市冬季重度霾污染期间PM2.5和PM10中细菌群落特征，结果显示，细菌种属多样性较高且检测到致病菌属的存在。大气中细菌菌属对营养及生长因子的需求比较多样，这就导致了培养基选择上的困难[8]，基于培养方法获得的微生物信息可能会遗漏一些重要的致病菌或过敏源[9]。高通量测序技术相比传统的培养方法有着巨大的优势，利用高通量测序分析技术对细菌基因组中高度保守又特异性变化的16S区进行测序分析，能检测到大量不可培养的菌种，尤其是低丰度菌种，高通量测序技术已成为微生物生态学研究的一个有效的技术工具[10]。本研究以PM2.5中细菌种群为研究对象,采集新乡市4个季节大气PM2.5样品,利用高通量测序术对PM2.5中的细菌种群结构进行检测分析,讨论4个季节大气PM2.5中细菌种群分布特征和季节变化差异,旨在了解该地区大气环境的质量状况,为从微生物角度阐明PM2.5对人体健康的影响提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器TE-6070大流量颗粒物采样器(美国Tisch公司),高纯玻璃纤维滤膜(北京赛福莱博科技有限公司),二氧化硫分析仪、43i氮氧化物分析仪、48i一氧化碳分析仪、49i臭氧分析仪、1405-BEF PM10颗粒物监测仪、1405F-BVF PM2.5颗粒物监测仪、146i-DT3BEAA多元动态校准仪、111-B2R零气发生器、WS500-umb气象五参数(丹麦HermoScientific公司)，810H数据采集仪(深圳研祥智能科技),YQTS-711减压阀(上海减压阀厂)。

1.2 PM2.5样品采集采样地点在新乡医学院院系楼楼顶(采样口距离地面约22 m)。采样时间选择春、夏、秋、冬4个季节任意时间,每个季节采样3 d,春季、夏季、秋季、冬季采样时间分别为2017年4月、2017年9月、2017年11月、2018年1月。每天采样24 h(当日10:00至次日10:00)。每天采样结束后的滤膜置于-20 ℃下保存，每个季节采样结束后统一提取PM2.5样品细菌基因组DNA。

1.3 4个季节空气质量和气象指标测定分别于取样结束后记录由1.1所列仪器自动测定的空气质量指标(PM2.5、PM10、SO2、CO、NO2、O3)和气象指标温度(temperature,T)和相对湿度(relative humidity,RH)，取24 h平均值。

1.4 PM2.5样品细菌基因组DNA提取和高通量测序采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)对PM2.5中细菌基因组DNA进行提取，质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。利用16S V4区特异引物515F(5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′)进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,反应条件为98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。使用TruSeqTMDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒对PCR产物进行文库构建，经过Qubit和实时定量PCR(real-time quantitative PCR，Q-PCR)定量，文库合格后使用Illumina HiSeq 2500 PE250进行高通量测序，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

2 结果

2.1 4个季节空气质量和气象资料结果见表1。4个季节的PM2.5浓度，冬季最高，其次为春季、秋季和夏季;PM2.5污染在冬季和春季最为严重。夏季O3浓度最高，其余依次为春季、冬季和秋季;O3污染在夏季最为严重。春季、夏季和秋季的相对湿度差别不大，冬季相对湿度最低。

表1 4个季节空气质量和气象资料

指标春季夏季秋季冬季T/℃17.5±0.528.5±3.510.2±4.6-0.1±3.8RH/%58.0±9.052.3±17.157.0±9.044.2±14.4PM2.5/(μg·m-3)83.7±21.550.0±15.980.3±46.786.7±84.1PM10/(μg·m-3)156.0±25.689.0±26.2155.3±67.4128.0±106.2SO2/(μg·m-3)61.7±7.854.3±11.074.7±18.560.0±35.9CO/(μg·m-3)1.9±0.21.0±0.51.3±0.31.6±1.1NO2/(μg·m-3)32.7±4.921.3±11.229.3±6.728.3±24.1O3/(μg·m-3)65.7±8.5176.0±25.723.0±14.740.0±15.7

2.2 4个季节PM2.5样品稀释曲线结果见图1。4个季节PM2.5样品的稀释曲线均逐渐趋向平缓，说明测序量能够真实反映4个季节PM2.5样品中的细菌群落组成，4个季节PM2.5中细菌丰度依次为春季>冬季>夏季>秋季。

图1 4个季节PM2.5样品稀释曲线

Fig.1 Rarefaction curves of PM2.5samples in four seasons

2.3 4个季节PM2.5中细菌群落组成4个季节大气PM2.5中共检测到51个细菌门，相对丰度居前10位的分别为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、蓝藻门、酸杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门及浮霉菌门(表2)，其中，前4个细菌门相对丰度均在5.24%以上。

在菌属水平上,共检测到941个菌属,相对丰度居前10位的菌属分别为未鉴定叶绿体、水栖菌属、假单胞菌属、副拟杆菌属、未鉴定线粒体、大肠埃希菌·志贺菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、副球菌属、阿克曼菌属(表3)。春、夏、秋、冬季节相对丰度较高的菌属分别为乳杆菌属、乳杆菌属、未鉴定线粒体、未鉴定叶绿体。菌属水平未知菌属所占比例较高，春、夏、秋、冬4个季节分别为28.90%、42.78%、26.97%、29.49%。

表2 4个季节PM2.5样品中前10位细菌门类相对丰度

Tab.2 Relative abundance of the top 10 bacterial phyla in PM2.5samples in four seasons

细菌门春季夏季秋季冬季变形菌门37.35%34.23%41.81%28.65%放线菌门24.26%16.91%13.88%9.86%厚壁菌门23.90%17.76%23.79%26.63%拟杆菌门5.24%7.49%12.01%15.84%蓝藻门3.44%0.48%2.96%9.49%酸杆菌门1.71%6.90%0.66%1.66%疣微菌门0.47%3.86%0.43%2.46%芽单胞菌门0.82%2.46%0.24%0.85%绿弯菌门0.89%2.29%0.35%0.94%浮霉菌门0.39%1.25%0.22%1.08%

表3 4个季节PM2.5样品中前10位细菌属相对丰度

Tab.3 Relative abundance of the top 10 bacterial genera in PM2.5samples in four seasons

细菌属春季夏季秋季冬季未鉴定叶绿体3.38%0.33%2.90%9.27%水栖菌属0.02%0.46%4.13%0.02%假单胞菌属0.49%1.10%2.22%5.30%副拟杆菌属0.03%0.10%4.00%0.20%未鉴定线粒体1.18%0.22%4.57%1.53%大肠埃希菌·志贺菌属0.16%0.97%3.41%2.01%双歧杆菌属0.05%0.40%3.11%0.99%乳杆菌属7.01%3.58%2.74%1.29%副球菌属2.89%0.16%0.73%0.44%阿克曼菌属0.01%0.25%0.29%2.22%其他84.80%92.43%71.88%76.73%

2.4 4个季节PM2.5样品Alpha多样性分析结果见表4。春季和冬季PM2.5样品细菌群落的Chao1指数和ACE指数高于夏季和秋季，4个季节PM2.5样品中细菌群落丰度依次为春季>冬季>夏季>秋季,4个季节PM2.5样品中细胞群落多样性依次为夏季>春季>冬季>秋季。

表4 4个季节PM2.5样品细菌群落的Alpha多样性指数

Tab.4 Alpha diversity index of PM2.5bacterial community in four seasons

季节Chao1指数ACE指数Shannon指数Simpson指数春季2256.7462310.1218.6380.989夏季1624.6571618.5699.1910.996秋季1320.0451330.1727.0670.939冬季2090.0292080.8317.9140.967

2.5 4个季节PM2.5中细菌群落Beta多样性指数比较结果见图2。春季、夏季、秋季PM2.5中细菌群落Beta多样性指数两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，春季和冬季PM2.5中细菌群落Beta多样性比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 4个季节PM2.5样品Beta多样性组间差异箱形图

Fig.2 Box diagram of differences among groups in Beta diversity of PM2.5samples in four seasons

3 讨论

2015年全球疾病负担报告显示，颗粒物污染成为排名第7位的危险因素，在中国成为排名第6的危险因素，我国每10万死亡人群中有163.1人死亡与空气污染有关[11]。李文静等[12]探讨了2013～2015年北京市大气PM2.5对医院儿科门诊量的影响，单污染物模型分析显示，PM2.5对儿科总门诊量、儿科呼吸系统疾病门诊量和儿科其他疾病门诊量的影响均有统计学意义，且以当天的效应最强，PM2.5浓度每升高 10 μg·m-3，上述门诊量分别增加0.525%、0.589%、0.393%。多污染物模型分析结果显示，引入其他污染物后，PM2.5对儿科总门诊量和呼吸系统疾病门诊量的影响仍有统计学意义，PM2.5浓度每升高 10 μg·m-3，上述门诊量分别增加0.570%、0.697%。PM2.5中微生物浓度随PM2.5浓度增加而相应升高，微生物和过敏原介导的呼吸道疾病也相应增加[6]。春季和冬季是呼吸道疾病的高发季节，且PM2.5的浓度也较高，根据本研究结果，春季和冬季样品细菌丰度高于夏季和秋季，与文献[12]报道相一致。

王步英等[7]检测了2013年北京市冬季连续7 d PM2.5样品中细菌种群，在门的水平上，放线菌门所占比例最高，达62.34%，其次是厚壁菌门(14.64%)、变形菌门(11.47%)、蓝藻门(5.45%)和拟杆菌门(3.46%)。在属的水平上，主要菌属均为节杆菌属，其次为弗兰克菌属。本研究中，冬季PM2.5样品中，在门的水平，相对丰度最高的是变形菌门(28.65%)，其次是厚壁菌门(26.63%)、拟杆菌门(15.84%)、放线菌门(9.86%)和蓝藻门(9.49%)。在属的水平，相对丰度最高的是未鉴定叶绿体，其次是假单胞菌属。由此可见，不同地域PM2.5中细菌种群差异较大。

本研究中，采样点是在校园内，每个季节仅采集3个样品，且环境因子对人体健康的影响有低剂量、长时间、多途径以及累积联合作用等特点，不能全面代表新乡市整体情况，需要增加采样时点，联合PM2.5中其他组分，结合门诊情况，深入探讨PM2.5中细菌对人体健康的影响。