血浆循环肿瘤DNA与宫颈癌临床病理、疗效及预后的关系

廖丽川，孟以秀，向安玲，赵昌芹

(重庆市开州区人民医院妇科，重庆 405400)

宫颈癌是目前世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，有数据统计其发病率基本维持在334/10万～555 /10万人左右[1]。在我国，每年新发病例约10万，占全世界新发病例总数的1/5，且近年有明显上升趋势，多呈年轻化，给女性生活和生命健康带来极大威胁[2]。宫颈癌筛查是其主要诊断途径，主要包括高危型人乳头状瘤病毒(HPV)、宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)、阴道镜检查及宫颈组织活检等，但仍有部分患者觉得以上检查繁琐且有一定不舒适感而拒绝[3]。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一种因实体肿瘤细胞凋亡或破裂而释放进入外周循环系统的基因片段，主要存在于血液、脑脊液及滑膜液等液体中，具有与原发肿瘤组织一致的特性，提示了其在肿瘤诊疗中的价值[4-5]。近年，有研究发现ctDNA可真实体现不同治疗手段下早期或晚期非小细胞肺癌肿瘤负荷变化，突出了其在恶性肿瘤诊疗中价值[6]。但关于其与宫颈癌临床病理、疗效及预后的关系的研究少见，具有一定探讨价值。本文研究ctDNA在宫颈癌和正常女性中的差异，并探讨其与宫颈癌临床病理、疗效及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年1月于重庆市开州区人民医院诊治的188例宫颈癌患者作为研究对象，命名为宫颈癌组。纳入标准：(1)符合《妇产科学·八年制·第二版》[7]中宫颈癌诊断者；(2)国际妇产科联盟(FIGO)分期[8]在I-III期者；(3)首次诊断者；(4)均接受手术或同步放化疗治疗者，且临床资料完整者；排除诊断：(1)合并其它原发恶性肿瘤者；(2)入组前接受任何治疗者；(3)有精神病史或家族史者。同时选取同期于本院体检的200例健康女性为健康对照组。本研究所有研究对象均签署知情同意书，并通过伦理委员会批准。宫颈癌组：年龄(49.16±6.35)岁；体重指数(BMI)(24.96±2.35)kg/m2；健康对照组：年龄(49.31±6.54)岁；BMI(24.42±2.12)kg/m2。两组在年龄及BMI等一般资料上比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 抽取宫颈癌组治疗前后和健康对照组5 mL空腹静脉血于EDTA抗凝管中，充分混匀，2 h内以4 000 r/min 离心5 min分离血浆，并将其保存于-80 ℃冰箱中待集齐检测。

1.2.2 检测方法 主要分为两步：第一，采用两步磁珠法(北京臻和科技有限公司)提取血浆游离DNA， 具体参照操作说明书：准备一个干净离心管，并向其中分别加入100 μL血浆、10 μL蛋白酶K、185 μL缓冲液、15 μL异丙醇和20 μL磁珠，漩涡振荡，使其充分均匀以得到磁性分离，后将上清液移至新离心管，即得到纯化游离DNA；第二，采用Nanodrops 2000分光光度计(美国Thermo Scientific公司)检测游离DNA含量。采用受试工作者曲线(ROC)确定ctDNA高低表达临界值：以ctDNA含量≥14.64为高表达(102例)；以ctDNA含量<14.64为低表达(86例)。

1.3 随访

本研究对宫颈癌组患者随访3年，收集患者3年无进展生存(progression free survival，PFS)和3年总生存(overall survival，OS)情况。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组ctDNA含量比较

宫颈癌组ctDNA含量为(15.76±3.18)ng/mL，高于健康对照组(7.82±1.63)ng/mL，差异有统计学意义(t=31.218，P=0.001)。

2.2 ctDNA与宫颈癌临床病理的关系

ctDNA含量在组织学分级、浸润间质深度、淋巴转移及FIGO分期上差异显著，有统计学意义(P<0.05)，以高分化、浸润间质深度≥1/2、存在淋巴转移及FIGO III期者为ctDNA高表达者居多，反之则为低表达者；但在年龄、肿瘤大小和是否累积子宫下段上差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 ctDNA与宫颈癌临床病理的关系(%)

2.3 ctDNA与宫颈癌治疗的关系

治疗前宫颈癌 ctDNA含量为(15.76±3.18)ng/mL，治疗后ctDNA含量(10.37±2.69)ng/mL，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 ctDNA与宫颈癌预后的关系

随访3年，与高表达者比较，低表达者DFS生存率和OS生存率明显增高(44.12%vs.62.79%；47.06%vs.67.44%)，差异有统计学意义(χ2=6.526,P=0.011；χ2=7.883，P=0.005)。见图1。

2.5 影响宫颈癌预后的多因素COX回归分析

经多因素COX回归分析得知，有淋巴转移、FIGO III期和ctDNA高表达是影响宫颈癌预后的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响宫颈癌预后的多因素COX回归分析

赋值：组织学分级(中低分化=1；高分化=0)、浸润间质深度(≥1/2=1；<1/2=0)、淋巴转移(是=1；否=0)、FIGO分期(I=1；II=2；III=3)、ctDNA含量(高表达=1；地表达=0)。

3 讨论

近年，我国医疗技术进步迅速，宫颈癌诊疗技术提高是其重要体现之一，但其死亡率仍居高不下[9]。究其原因，大部分学者认为这与肿瘤异质性有关，这是在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞历经数次分裂和增殖后，其子代在基因组、蛋白组及表观遗传学上发生变化，最终造成其在增殖、转移、侵袭、治疗及预后上各具差异[10-11]。目前关于肿瘤异质性的检测主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、播散肿瘤细胞(disseminated tumor cell,DTC)及ctDNA等，为患者精准治疗打下坚实基础[12]。近年ctDNA研究火热，研究发现，ctDNA核酸序列与肿瘤组织样本来源肿瘤特异性核酸序列高度一致[13]；而ctDNA在不同癌症类型和同一癌症类型不同个体之间差异较大，在同一个体中，可随“肿瘤负荷情况”及疾病严重程度变化，高浓度ctDNA即预示着恶性程度高、肿瘤晚期或不良预后[14-15]。

在本研究中，通过对比分析188例宫颈癌患者和200例健康体检女性血浆ctDNA含量发现宫颈癌血浆ctDNA含量明显高于健康人群，与国内外主流意见基本一致[16-17]，提示血浆ctDNA检测对宫颈癌诊断可能具有一定价值。此后，本研究还探讨了血浆ctDNA与宫颈癌临床病理特征之间的关系，发现其在高分化、浸润间质深度≥1/2、存在淋巴转移及FIGO III期患者中为ctDNA高表达者(P<0.05)，而在不同年龄、肿瘤大小及是否累积子宫下段上差异不明显(P>0.05)，提示其可作为临床病理特征的参考指标，为手术医师术前评估肿瘤情况提供依据。此外，本研究还探讨了血浆ctDNA与宫颈癌治疗疗效及预后之间的关系，发现与治疗前比较，治疗后宫颈癌患者血浆ctDNA含量明显降低(P<0.05)，说明其对患者治疗疗效评估可能有一定参考价值，这是因为ctDNA含量在一定程度上可提示肿瘤负荷变化，从而反映治疗效果。随访3年，与血浆ctDNA高表达者比较，低表达者DFS生存率和OS生存率明显增高(P<0.05)，提示血浆ctDNA与宫颈癌预后密切相关。众多研究表明，治疗前ctDNA是影响肿瘤预后的独立危险因素，以非小细胞肺癌、乳腺癌及卵巢癌等中较为多见[18]，但在宫颈癌预后中的评估价值尚不明确。本研究前述提示ctDNA与宫颈癌预后密切相关，具体价值尚不明确，为此本研究进行了预后影响因素的多因素COX回归分析，发现有淋巴转移、FIGO III期和ctDNA高表达是影响宫颈癌预后的独立危险因素，前面两者是临床较为成熟的结论，而后者则为宫颈癌预后评估提供了新的方向，为提高预后评估准确率作出了贡献。

综上认为，宫颈癌患者中血浆ctDNA含量较高，在不同组织学分级、浸润间质深度、淋巴转移及FIGO分期等临床病理特征上差异明显，与治疗及预后相关，有望成为宫颈癌临床诊疗及预后检测的有效指标。但至今为止，血浆ctDNA检测技术仍是影响临床推广的重要原因，提高检验技术是后续研究的重点之一。