血管通透因子、DCC基因及MMP-9蛋白在胃癌患者中的表达水平研究

李程亮，辛宏，王敏娟，石穎鹏

(西安医学院第一附属医院全科医学科，陕西 西安 710077)

胃癌是临床上较为常见的消化系统恶性肿瘤，在我国常见的恶性肿瘤中，胃癌发病率一直居于前列[1]。据世界卫生组织统计数据显示，全球范围内每年会有接近100万的胃癌死亡病例，严重威胁着患者的生命安全。绝大多数胃癌患者早期无明显症状，这也导致了目前我国胃癌的早期诊断率相对较低，因此如何提高胃癌早期诊断率是当前许多学者主要的研究课题[2]。血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)作为一种诱导能力很强的因子，能够刺激细胞的增殖、迁移，在肿瘤的形成中起到重要的作用；基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)蛋白能为癌细胞的转移创造条件，在肿瘤细胞转移过程中发挥重要作用[3-4]；结直肠癌缺失 (deleted in colorectal cancer，DCC)基因是目前临床上发现的最长的抑癌基因。本研究对VPF、DCC及MMP-9在胃癌症状中的表达进行分析研究，旨在研究三者与胃癌症状发病的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2017年3月至2018年3月在西安医学院第一附属医院检查确诊并进行手术治疗的胃癌患者50例，其中包括男性30例，女性20例，年龄40～75岁，平均年龄(58.3±5.8)岁，腺癌患者18例，腺鳞癌患者16例，鳞癌患者13例，其他3例。排除标准：病历资料不全患者；并发其他类型恶性肿瘤患者；接受过放疗、化疗治疗的患者；心脑血管疾病患者；精神疾病患者。所有研究对象及家属均知情同意，并获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 取所有患者手术切除癌组织标本以及与癌组织距离5 cm以上的癌旁正常胃黏膜组织，使用4%中性福尔马林对所采集的标本进行固定，并进行常规石蜡包埋，之后进行连续切片作免疫组化标记以及革兰染色待用。

1.2.2 免疫组化染色处理 将待测标本放在二甲苯中脱蜡处理10 min，将二甲苯更换后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修复液，在37 ℃的恒温冰箱中孵化30 min，弃抗原修复液；切片移入湿盒中加入浓度为3%的H2O2，去过氧化物酶封闭液，恒温冰箱孵育10 min，采用PBS淋液冲洗；加入适量的山羊血清，在室温环境下封闭30 min；用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，然后再加入二抗，室温孵育1 h，采用PBS淋液冲洗；经过DAB显色处理10 min，能够在显微镜下观察到棕黄色阳性反应，则采用PBS淋液冲洗1 min；使用苏木精复染3 min，然后用浓度为1%的盐酸乙醇分化处理，自来水冲洗1 min后，脱水并封片处理。

1.2.3 酶联免疫吸附法检测VPF表达 将待测的标本和酶标物严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤与和固相载体产生反应作用，将固相载体反应的复合物经过洗涤与其他物质分离，加入酶反应底物，经过酶的催化作用形成有色物质，根据颜色的深浅进行定性或定量分析VPF的表达。

1.2.4 荧光定量RT-PCR检测DCC基因表达 采用荧光定量RT-PCR技术进行检测，严格按照定量PCR仪的操作说明书进行。依次加入2.5 μL的稀释10倍的PCR缓冲液，1.5 μL MgCl2溶液，0.5 μL上游引物和下游引物，最后加水配成总体积为25 μL的反应体系。在94 ℃环境中反应1 min；55 ℃环境中反应1 min；72 ℃环境中反应1 min，进行35个循环，72 ℃环境中反应延长5 min，重复最少3次。采用2-△△Ct方法计算出需要检测的DCC基因。

1.2.5 Western blot检测MMP-9蛋白表达 将待测标本使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，进行裂解35 min，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，通过10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100 V，电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，在37 ℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释按(1∶1 000)稀释一抗Tubulin(内参照)，在4 ℃的环境下孵育过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液清洗反复清洗。最后，加入显影剂将其在底物溶液中进行显色，严格按照显影定影试剂盒操作说明书进行，采用目的蛋白条带分析灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 癌旁组织、癌组织病理组织学观察

如图1所示，癌旁组织细胞排列较为紧密，大小均匀，形态一致，细胞核圆润，无核分裂现象；胃癌组织细胞大小不等，排列较为紊乱、疏松、不规则，细胞核形态多样，多有核分裂现象。

2.2 癌组织与癌旁组织中VPF、DCC及MMP-9表达对比

如表1所示，癌组织中VPF、MMP-9阳性表达率显著高于癌旁组织，DCC基因阳性表达率显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1癌组织与癌旁组织中VPF、DCC及MMP-9表达对比[n(%)]

组别VPFDCCMMP-9癌旁组织(n=50)4(8.00)47(94.00)3(6.00)癌组织(n=50)29(58.00)40(80.00)28(56.00)t值28.274.3329.22P值<0.05<0.05<0.05

2.3 VPF、DCC及MMP-9阳性表达的相关性分析

如表2所示，胃癌患者VPF、DCC及MMP-9阳性表达率与性别、年龄无关，与病理分期、淋巴结转移情况、肿瘤体积、浸润程度以及分化程度有关，Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴结转移、肿瘤体积较大、侵及浆膜以及分化程度较高的患者VPF、MMP-9阳性表达率较高，DCC基因阳性表达率较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 VPF、DCC及MMP-9阳性表达的相关性分析[n(%)]

3 讨论

胃癌是一种临床上较为常见的恶性肿瘤，起源于患者胃黏膜上皮，是人体消化系统中最常见的恶性肿瘤[5]。胃癌发病率在我国一直居高不下，并且随着社会发展，人们生活节奏不断加快，饮食不规律，导致胃癌症状发病率不断提升，严重影响着人们的生活质量及生命安全[6]。

据相关流行病学调查结果显示，胃癌的主要危险因素包括吸烟饮酒、不健康食品以及胃病史和家族史等，目前诊断胃癌的公认标准依旧是胃镜活检，但是使用该方法检测出胃癌时，癌细胞很可能已经发生转移。绝大多数胃癌患者早期无明显症状，这也导致了目前我国胃癌的早期诊断率相对较低，因此如何提高胃癌早期诊断率是目前大多数学者主要的研究课题[7-8]。随着临床诊断技术的不断进步，血清指标及肿瘤标志物检测逐渐应用于胃癌患者的诊断中，临床中有价值的肿瘤标志物有很多，如糖链抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)等。但是，这些肿瘤标志物在多种恶性肿瘤中均会呈现异常表达，因此对于胃癌症状的临床检测特异性较低，诊断效能也不理想[9-10]。

VPF又称血管内皮生长因子[11]，是一种促血管内皮细胞生长因子，具有高度的特异性，能提高人体血管的通透性，且能够一定程度上促进细胞外基质变性以及血管形成，是近年来临床上确定的一种具有旁分泌机制的血管生成因子[12]。VPF作为一种具有较强诱导能力的因子，能够特异性地作用于血管内皮细胞，刺激细胞的增殖、迁移以及诱导血管的生长，在肿瘤的血管形成过程中起到重要的参与作用，徐铖等[13]通过研究发现血管通透因子在胃癌患者体内呈现高表达。VPF是腹膜转移的一种重要的预测因子，在临床上较为常见的恶性肿瘤的相关研究中，均发现了VPF的较高表达。李君强等[14]研究提出，如果肿瘤组织大部分出现坏死，产生的VPF肿瘤细胞会减少；如果出现缺血和缺氧的诱导因素，也不会生成太多的VPF，患者血清中的VEGF水平也会降低。相反情况下，如果大多数的肿瘤组织处于缺血和缺氧的环境下，其程度达不到肿瘤组织坏死的程度时，肿瘤组织会在缺血和缺氧的诱导下生成大量的VPF，患者血清中的VPF浓度也随之上升。本研究对胃癌患者血清VPF水平进行了检测，结果显示，在胃癌症状中，血清VPF阳性表达率较高，说明VPF参与了胃癌的发生及发展过程，与胃癌症状的发展程度具有一定的相关性。

基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)是一组内肽酶，主要依赖于锌离子，其中成员分子量大小不同，底物也不完全相同[15]。MMP-9是基质金属蛋白酶家族的一种，其作为一种Ⅳ型的胶原蛋白，主要作用是降解细胞外基质，还能够降解明胶、纤维结合素、弹性蛋白等[16-17]。杨云鹏等[18]研究发现，MMP-9对Ⅳ胶原蛋白产生破坏，降解细胞外基质从而促进胃癌细胞发生上皮间充质转化，转移到临近其他健康组织中，为胃癌细胞的转移创造条件，在胃癌细胞转移过程中发挥重要作用。本研究中对胃癌组织中MMP-9表达进行检测，结果显示在胃癌组织中MMP-9蛋白阳性表达率较高，说明MMP-9蛋白水平与胃癌症状的发生及发展有着密切的联系，与张静怡等[19]的研究结果一致。DCC基因是上个世纪发现的一种抑癌基因，近年来有许多专家学者通过实验研究证明了DCC基因在结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中呈现较低表达，但是关于其与胃癌症状关系的报道相对较少。张跃等[20]通过研究表明，DCC基因具有诱导肿瘤细胞凋亡，若人体DCC基因水平出现异常，很有可能会出现细胞恶变。本文研究结果还发现，胃癌患者DCC基因水平出现明显的下降，可能是由于DCC基因出现异常表达，导致细胞恶化，说明DCC基因水平与胃癌发生发展有密切联系。

综上所述，血清VPF、DCC基因及MMP-9蛋白水平在胃癌症状中呈现异常表达，且具有一定相关性，为胃癌的临床诊断提供一定的价值帮助。