盐酸米诺环素对牙周炎大鼠的治疗效果及对大鼠IL-8、hs-CRP、TNF-α的影响

刘永召，郑瑞，韩淑伶

(1.武警天津市总队医院五官科，天津 300162；2.天津市第三中心医院神经外科，天津 300170)

牙周炎是一种常见的慢性牙科疾病，主要是由细菌感染及其细菌产物造成，所以对牙部病菌的抑制成为治疗牙周炎的关键手段[1]。目前，临床上一般采用机械治疗慢性牙周炎，主要是去除牙菌斑和牙结石，并且服用抗生素进行辅助治疗[2]。盐酸米诺环素作为一种广谱类抗菌素，能够对各类的牙周炎病菌起到很好的控制效果，已成为治疗牙周炎的主要药物[3]。本研究通过构建牙周炎大鼠模型，对牙周炎大鼠分别给予碘甘油和盐酸米诺环素进行治疗，探究盐酸米诺环素对牙周炎的临床效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取由解放军总医院实验动物研究中心提供的120例Wistar大鼠，雌雄不限，年龄3～6个月，平均年龄(3.8±1.5)月，体重200～250 g，平均(220±7.9)g。所有大鼠均养殖在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水。经过1周饲养后，随机分为基础治疗组和盐酸米诺环素组，每组各60例，两组大鼠的年龄、体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，实验已经过伦理会批准。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎大鼠模型建立 给予120例大鼠静脉注射30 g/L戊巴比妥钠麻醉，麻醉后将大鼠右上颌第1个磨牙牙周和牙根面分离，然后使用正畸钢丝将牙颈部结扎，喂养大鼠高糖饲料，包括：蔗糖55 g，脱脂奶粉30 g，酵母粉5 g，面粉5 g，肝粉2 g，200 g/L的高糖水以及少量的食盐和新鲜蔬菜，喂养持续4周后，检测探诊深度，深度达到2 mm以上说明大鼠牙周炎模型建立成功，若达不到则继续喂养，直至模型成功建立。

1.2.2 治疗方法 两组大鼠在用药治疗前均采取牙龈清洁手段和牙龈刮治清除术等常规治疗，待大鼠炎症扩散情况稳定后对两组大鼠采取用药物治疗。基础治疗组大鼠采用碘甘油进行治疗，采用无菌镊子加入无菌棉浸泡入碘甘油中，吸满之后涂抹于大鼠的牙周袋上，每天涂抹2次，涂抹4周。盐酸米诺环素组大鼠采用盐酸米诺环素进行治疗，将装有盐酸米诺环素的注射剂垂直深入大鼠的牙周袋内，缓慢匀速推进牙周袋内使其注满并且溢出为止，每周用药1次，治疗4周。在治疗后1 h内禁止大鼠饮水或者进食，防止药物的浓度降低影响治疗效果。治疗结束后观察大鼠一般形态，并作记录。

1.2.3 切片及染色 随机选取两组中1只大鼠静脉注射30 g/L戊巴比妥钠麻醉处死后，取大鼠实验侧颌骨进行固定、脱钙、包埋处理，并做石蜡切片。对两组大鼠切片样本进行染色处理，使用二甲苯进行常规脱蜡处理2次，每次5 min，然后在梯度酒精下水花处理3 min，自来水冲洗1次；使用苏木素染色5 min，自来水冲洗1次；使用浓度为1%的盐酸酒精分化处理30 s，在0.2%氨水中反蓝处理2 min，自来水冲洗1次；在浓度0.5%伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片，使用光学显微镜进行图像分析。

1.2.4 标本采集 将大鼠固定后，将大鼠尾部浸泡置50 ℃温水中2 min后擦干鼠尾，用手术剪剪去大鼠尾尖7 mm，采集血液5 mL，放置在干净EP管中，做好标志后冻存置-50 ℃冰箱中，用于外周血中白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、超敏C-反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测；将待测大鼠用乙醚麻醉后，断头处死，5 min内切去大鼠右上颌第1、2磨牙颊腭侧实验处的牙龈组织，加入其20倍体积的离心缓冲液，手动均桨10 min，用离心机以2 000 r/min的转速分离，取上层血浆电动匀浆后，用离心机以3 000 r/min的转速分离，取上层血浆放置-50 ℃的冰柜中冻存，用于牙龈组织中IL-8、hs-CRP、TNF-α检测。窃取大鼠M2磨牙区组织块，在沸腾的蒸馏水中蒸煮5min后取出，刮去其附着的软组织，带冷却后放入3%的过氧化氢溶液中过夜，然后用0.1%的亚甲基蓝染色，1 min后吸去多余染液，使其自然风干，用于牙槽骨吸收长度及面积的检测。

1.2.5 ELISA法检测IL-8、hs-CRP、TNF-α表达 采用酶联免疫吸附法，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，在ELISA试剂盒中加入待测样本，使血清和固相抗原充分结合，洗涤去除杂质后加入微孔板酶标仪中，经过酶标抗体反应形成复合物后再加入底物显色，通过比色检测血清中IL-8、hs-CRP、TNF-α的量，进行指标水平比较。

1.2.6 临床指标检测 两组大鼠在治疗前和治疗4周后对牙部的临床指标进行检测评分，检测大鼠牙周PD、PLI以及SBI指数评分，判定大鼠治疗前PD、PLI和SBI的指标水平和治疗后的水平差异。PD指数评分：0分表示探诊深度为1～2 mm；1～3分表示探诊深度为3～5 mm；4～5分表示探诊深度≥5 mm。PLI指数评分：0分表示牙龈边缘区没有菌斑；1分表示牙龈边缘区有很薄的菌斑，但可以忽略；2分表示牙龈边缘有中等量的菌斑覆盖；3分表示牙龈边缘及邻近部位有大量菌斑覆盖。SBI指数评分：1分表示基本健康有轻度炎症，龈沟不出血；2分表示轻度炎症探诊后点状出血；3分表示牙龈有中度炎症，牙龈血不溢出；4分表示牙龈有中度炎症，牙龈血溢出；5分表示重度炎症，明显肿胀，自动出血。

1.2.7 M2腭侧牙槽骨吸收长度和吸收面积测定 使用体视镜拍摄标本同一水平腭侧，取M2腭侧釉牙骨质界近中、根分叉处以及远中各3个点位，用体视镜CCD自带软件测量这3个点位与牙槽嵴顶的距离，3个长度之和即为M2腭侧牙槽骨吸收长度。用体视镜CCD自带软件测量M2腭侧染色面积，即M2腭侧牙槽骨吸收面积。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般形态观察

如图1所示，基础治疗组大鼠食欲略有回升，毛色逐渐变亮，精神状态有所恢复，牙龈炎症逐渐减轻，仍可见有牙周袋，探诊有出血现象，但出血均在牙龈沟内，牙周组织有所恢复。盐酸米诺环素组大鼠食欲恢复正常，毛色光亮，具有良好的精神状态，大鼠牙龈处无红肿现象，牙面与牙龈组织紧密贴合，探诊无出血，较基础治疗组大鼠牙周袋显著变浅，存在明显修复的牙周组织迹象。

2.2 病理组织学观察

如图2所示，为两组大鼠牙周组织病理学观察图，基础治疗组大鼠病理图显示牙周袋内存在大量的炎性细胞，牙周膜纤维排列不齐，可见牙槽面存在骨吸收陷窝，可见破骨、成骨细胞，牙龈上皮及皮下结缔组织存在炎性浸润；盐酸米诺环素组大鼠病理图显示炎症反应较基础治疗组明显减少，牙周膜纤维排列整齐，成纤维细胞增多，牙龈上皮及皮下结缔组结构完整，牙槽面有大量的成骨细胞。

2.3 外周血及牙龈组织中IL-8表达水平比较

如表1所示，基础治疗组和盐酸米诺环素组大鼠在治疗前外周血及牙龈组织中IL-8表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两组大鼠治疗后外周血及牙龈组织中IL-8表达水平均显著低于治疗前(P<0.05)；盐酸米诺环素组大鼠在治疗后外周血及牙龈组织中IL-8表达水平均明显低于基础治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

组别外周血中IL-8(pg/mL)治疗前治疗后牙龈组织中IL-8(μg/L)治疗前治疗后基础治疗组(n=60)2.01±0.061.57±0.040.72±0.040.37±0.02盐酸米诺环素组(n=60)1.99±0.071.39±0.050.71±0.050.29±0.02t值1.6821.771.2121.91P值>0.05<0.05>0.05<0.05

2.4 外周血及牙龈组织中hs-CRP表达水平比较

如表2所示，基础治疗组和盐酸米诺环素组大鼠在治疗前外周血及牙龈组织中hs-CRP表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两组大鼠治疗后外周血及牙龈组织中hs-CRP表达水平均低于治疗前(P<0.05)；盐酸米诺环素组大鼠在治疗后外周血及牙龈组织中hs-CRP表达水平均明显低于基础治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

组别外周血中hs-CRP(ng/mL)治疗前治疗后牙龈组织中hs-CRP(mg/L)治疗前治疗后基础治疗组(n=60)17.85±4.6511.25±3.496.50±0.054.37±0.06盐酸米诺环素组(n=60)17.06±5.347.84±2.826.51±0.064.12±0.35t值0.865.890.995.45P值>0.05<0.05>0.05<0.05

2.5 外周血及牙龈组织中TNF-α表达水平比较

如表3所示，基础治疗组和盐酸米诺环素组大鼠在治疗前外周血及牙龈组织中TNF-α表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两组大鼠治疗后外周血及牙龈组织中TNF-α表达水平均显著低于治疗前(P<0.05)；盐酸米诺环素组大鼠在治疗后外周血及牙龈组织中TNF-α表达水平均明显低于基础治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.6 PD、PLI和SBI指标比较

如表4所示，两组大鼠经过治疗后，PD、PLI和SBI指标相比治疗前明显降低，盐酸米诺环素组大鼠治疗后的PD、PLI和SBI水平低于基础治疗组，差异具有统计学差异(P<0.05)。

组别外周血中TNF-α(ng/L)治疗前治疗后牙龈组织中TNF-α(pg/mL)治疗前治疗后基础治疗组(n=60)9.31±2.566.17±1.824.62±0.973.21±0.55盐酸米诺环素组(n=60)9.27±2.143.74±1.174.58±1.021.97±0.48t值0.098.700.2213.15P值>0.05<0.05>0.05<0.05

表4 两组大鼠治疗前后PD、PLI和SBI比较

2.7 M2腭侧牙槽骨吸收长度和吸收面积比较

如表5所示，盐酸米诺环素组大鼠治疗后M2腭侧牙槽骨吸收长度和吸收面积均明显低于基础治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

组别M2腭侧牙槽骨吸收长度(mm)M2腭侧牙槽骨吸收面积(mm2)基础治疗组(n=60)0.37±0.032.84±1.23盐酸米诺环素组(n=60)0.29±0.021.65±0.64t值17.186.81P值<0.05<0.05

3 讨论

牙周炎是一种常见的炎症疾病，发病原因主要是患者口腔内部受到了细菌感染，从而导致了牙龈的萎缩，对牙周组织产生了严重的破坏性[4]。患有牙周炎的部分患者会出现前牙位移状况，致使牙周袋深度增加，产生牙齿松动、间隙加宽、出现咀嚼功能障碍等一系列问题[5]。目前，对龈下菌斑、牙结石和牙骨质病变的主要治疗手段是牙周刮治、牙菌斑的去除等一些基础治疗，随后局部给药。盐酸米诺环素在四环素类药物中抗菌性最强，对革兰阳性菌和阴性菌均有效，可灭活龈沟液中胶原酶，在局部长期形成高浓度而发挥抗菌作用。它还能使牙根面脱钙，刺激结缔组织中细胞在根面上迁移，促进细胞附着和生长，促进局部组织恢复，降低血清中炎性因子的表达水平。

hs-CRP是机体内血浆中的一种C反应蛋白，由肝脏合成，是全身炎症反应急性期的非特异性标志物，是预测心血管疾病最重要的预测因子之一[6]。在新生儿细菌感染、肾移植以及心血管疾病等方面均有极为重要的临床指导作用。本研究表明，牙周炎大鼠经盐酸米诺环素给药后，其血清中hs-CRP的水平比经基础治疗的大鼠更低。这可能是因为经盐酸米诺环素治疗后，大鼠患病部位菌斑减少，炎症减轻，对肝脏的刺激减弱，致使hs-CRP的表达减少。

TNF-α主要由巨噬细胞及单核细胞分泌产生，参与机体内正常的炎症反应及免疫反应[7]。TNF-α是目前医学界发现的活性最强的抗肿瘤细胞因子,它可以刺激中性粒细胞发挥作用，而且少量的TNF-α还有杀灭癌细胞的作用[8]。TNF-α可以作用于多种细胞，可以诱导IL-1β、IL-6、IL-8在人体内的分泌，从而导致白细胞、毛细血管组织的损坏，最终对全身器官及组织造成损害[9]。本研究表明，牙周炎大鼠经盐酸米诺环素给药后，其血清中TNF-α的水平比经基础治疗的大鼠更低。这可能是因为经盐酸米诺环素治疗后，大鼠牙周炎微生物减少，对TNF-α基因启动子的刺激减弱，使TNF-α的表达减少。

IL-8属于趋化家族的细胞因子，主要由单核巨噬细胞分泌产生，在哺乳动物生殖生理及病理过程中有重要的调节作用，IL-8几乎参与了哺乳动物的整个生殖及生长发育的过程[10]。IL-8主要的生物学活性是吸引及激活中性粒细胞，并释放一系列的活性产物，最终会导致机体局部的炎症反应，从而达到杀菌和细胞损伤的目的[11]。本研究表明，牙周炎大鼠经盐酸米诺环素给药后，其血清中IL-8的水平较经基础治疗的大鼠低。这可能是由于经盐酸米诺环素治疗后，大鼠牙周炎病情减缓，TNF-α表达水平降低，对中性粒细胞的刺激作用减弱减少，因而IL-8的表达水平也随着降低。

hs-CRP、TNF-α、IL-8均属于炎症因子。本文研究表明，牙周炎大鼠经过盐酸米诺环素治疗后，外周血及牙龈组织中hs-CRP、TNF-α、IL-8均有显著降低，说明盐酸米诺环素可以有效抑制牙周炎大鼠炎症反应的发生。李会英等[12]研究表明，牙周炎大鼠在经过治疗后，外周血中IL-8表达水平明显降低，与本文研究结果一致。但在其研究中，牙周炎大鼠经过治疗后IL-8表达水平低于本文研究结果，可能是与研究选取大鼠样本数有关，本文研究选取大鼠样本数量较多，结果可能会更加确切。

PLI称菌斑指数，主要是一种通过人体牙齿部位牙面的菌斑厚度来制定的一个评分标准，一般用于口腔卫生的评价和对牙周病的预防[13]；SBI称龈沟出血指数，主要是对患者牙龈的出血量做一个评分标准，能够更准确的反应炎症的程度[14]；PD称探诊深度，主要是通过使用牙周探针来测量患者的龈袋和牙周袋的深度，就是牙龈边缘到龈沟底部的距离，也是一项非常重要的牙周指标[15]。本文研究结果表明，盐酸米诺环素可以显著降低牙周炎大鼠PLI、SBI、PD指标水平及牙周炎大鼠M2腭侧牙槽骨吸收长度和吸收面积，治疗效果显著。

综上所述，盐酸米诺环素可以显著降低牙周炎大鼠外周血及牙龈组织中炎症因子水平，保护牙周组织，降低患者各项牙部临床指标水平及M2腭侧牙槽骨吸收长度和吸收面积，盐酸米诺环素对牙周炎可能会有显著的治疗效果。