循环血CCL2、CCL5、CXCL10在HBV相关性肝病中表达水平的差异及相关性分析

陈星，戢敏，喻雪琴，陈芳，梅怡晗，杨旺春

(1.川北医学院附属医院感染科，四川 南充 637000；2.首都医科大学朝阳医院，北京 610041；3.岳池县人民医院感染科，四川 广安 638350)

趋化因子是一种由免疫细胞产生的具有趋化白细胞功能的细胞因子，可上调整合素的表达水平，还能促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放，促进细胞增殖的作用[1]，其在炎症、肝组织纤维化、肿瘤逃逸、血管生成等机体多种病理生理过程中发挥主导作用，部分趋化因子及其衍生物或抑制物具有潜在的临床应用前景。按照N末端前2 个半胱氨酸位置不同，趋化因子分为4大类：CC亚族、C亚族、CXC 亚族、和CX3C亚族。其中，CCL2是炎症启始因子，它与单核细胞表面受体CCR2结合，使单核细胞聚集到炎症的发生部位，诱导与促进组织炎症的发生[2]；CCL5能驱化T淋巴细胞、 NK细胞，进而调节免疫功能。HBV感染后形成的慢性肝组织炎症是以Th1型细胞释放的促炎性因子介导为主，而CCL5通过调控Th1细胞释放促炎性因子，从而达到对肝组织炎症的调节作用。此外，趋化因子中的CCL5及其配体还可通过调节T淋巴细胞的免疫作用，从而促进肝星状细胞(HSC)的活化、增殖及浸润来调控肝组织纤维化的形成[3]。趋化因子中的CXCL10也参与了对T淋巴细胞一系列调控作用，从而导致病毒持续存在及肝组织炎症的发生、发展[4]。本研究的目的是了解CCL2、CCL5、CXCL10在HBV相关性肝病患者中的差异表达及其临床意义，以期找到HBV相关性肝病治疗的新思路与方法。

1 资料与方法

1.1 资料

选取2017年01月至2017年12月在川北医学院附属医院治疗的乙肝病毒携带者20 例(男性13 例，女性7 例)，年龄18～60 岁，平均年龄38.6 岁；慢性乙型肝炎患者75 例，其中慢性乙型肝炎轻度30 例(男性24 例，女性6 例)，年龄18～61 岁，平均年龄38.9 岁，慢性乙型肝炎中度25 例(男性16 例，女性9 例)，年龄18～62 岁，平均年龄39.1 岁，慢性乙型肝炎重度20 例(男性14 例，女性6 例)，年龄18～63 岁，平均38.2 岁；重型乙型肝炎患者20 例(男性15 例，女性5 例)，年龄18～60 岁，平均39.7 岁；HBV相关肝硬化患者20 例(男性14 例，女性6 例)，年龄18～67 岁，平均38.9 岁；乙肝肝癌患者20 例(男性16 例，女性4 例)，年龄18～65 岁，平均39.2岁。

纳入标准：(1)患者知情同意；(2)HBV相关性肝病诊断需符合中华医学会制定的标准[5]；(3)入院时未接受免疫调节和抗病毒治疗。排除标准：(1)排除其它嗜肝病毒感染以及其它原因所致的肝组织炎症；(2)合并其它疾病与非嗜肝病毒感染。选取同期20 例无HBV感染的健康志愿者为对照组(男性15 例，女性5 例)，年龄18～62岁，平均9.4岁，HBV相关性肝病患者与对照组在年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

所有研究对象均于入院后治疗前采集静脉血5 mL并分作两份，1 份自然抗凝后以1 000 r/min 离心10 min，取上清液采用酶联免疫吸附法测定血清中CCL2、CCL5、CXCL10水平，检测试剂盒购于武汉新启迪生物科技有限公司；HBV血清标志物检测使用Abbott/AxSYM试剂盒检测HBV感染标志物；HBV-DNA采用Mx3000 p 荧光实时定量PCR仪(美国Stratagene 公司) 检测；肝功能采用 7600-020全自动生化分析仪检测，严格按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 慢性乙型肝炎患者循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平与病情程度间的相关性分析

慢性乙型肝炎患者轻、中、重度组循环血CCL2、CCL5、CXCL10的表达水平与乙肝病毒携带者、健康对照组比较显著升高，且慢性乙型肝炎患者重度组水平最高，五者间比较，F值分别为824.90，595.51，810.41，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

组别例数CCL2(pg/mL)CCL5(pg/mL)CXCL10(pg/mL)健康对照组2037.46±1.4447.35±1.6135.47±2.92乙肝病毒携带组2036.59±1.9445.93±2.0134.60±2.04慢性乙型肝炎轻度组3050.90±3.76∗61.30±4.22∗53.33±5.75∗慢性乙型肝炎中度组2560.41±3.33#77.14±4.41#82.06±3.51#慢性乙型肝炎重度组20 81.77±2.79△90.66±4.05△102.30±7.30△F值824.90595.51810.41P值0.0010.0010.001

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与轻度组相比；△P<0.05，与中度组相比。

2.2 HBV相关性肝病患者间循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平差异的相关性分析

在HBV相关性肝病患者间，随着病情加重其循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平呈逐渐升高趋势，且重型乙型肝炎组升高水平最明显，六组间比较，F值分别为226.77、196.14、133.09，其差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

组别例数CCL2(pg/mL)CCL5(pg/mL)CXCL10(pg/mL)健康对照组2037.46±1.4447.35±1.6135.47±2.92乙肝病毒携带者组2036.59±1.9445.93±2.0134.60±2.04慢性乙型肝炎组7562.15±12.93∗74.41±12.69∗75.96±20.94∗重型乙型肝炎组25102.73±5.52#108.74±8.81#121.35±7.26#HBV相关性肝硬化组2091.25±3.96△102.28±6.17△107.13±8.56△HBV相关性肝癌组20101±7.76▲108.26±7.68▲109.08±11.36F值226.77196.14133.09P值0.0010.0010.001

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与慢性乙型肝炎组相比；△P<0.05，与重型肝炎相比组相比；▲P<0.05，与肝硬化相比。

2.3 HBV相关性肝病患者循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平与HBV-DNA载量间的关系

慢性乙型肝炎组患者循环血CCL2、CCL5、CXCL10水平与HBV-DNA载量呈正相关系(r值分别为0.32、0.3、0.41，P<0.05)；HBV相关性肝癌组CCL2水平与HBV-DNA载量呈正相关系(r值为0.57，P<0.05)，其余各HBV相关性肝病组的CXCL10、CCL2、CCL5水平与HBV-DNA载量无相关关系(P>0.05)。见表3。

表3HBV相关性肝病患者循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平与HBV-DNA载量间的关系

HBV-DNA(ng/mL)CCL2(ng/mL)r值P值CCL5(ng/mL)r值P值CXCL10 (ng/mL)r值P值健康对照组//////乙肝病毒携带者组0.250.28-0.020.940.230.34慢性乙型肝炎组0.320.010.370.010.410.00 慢性乙型重型肝炎组0.320.16-0.340.14-0.150.52HBV相关性肝癌组0.570.010.200.410.240.32HBV相关性肝硬化组-0.090.720.030.90-0.050.82

2.4 HBV相关性肝病患者循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平间的关系

慢性乙型肝炎组CCL2、CCL5、CXCL10表达水平间呈正相关系(r值为0.88、0.88，P<0.05)，其余各HBV相关性肝病患者组CCL2、CCL5、CXCL10表达水平间无相关关系(P>0.05)。见表4。

表4HBV相关性肝病患者循环血CCL2、CCL5、CXCL10表达水平间的关系

CXCL10 (ng/mL)CCL2(ng/mL)r值P值CCL5(ng/mL)r值P值健康对照组-0.160.490.460.04乙肝病毒携带者组0.300.19-0.340.14慢性乙型肝炎组0.880.000.880.00慢性乙型重型肝炎组0.260.29-0.530.02HBV相关性肝癌组-0.150.54-0.140.95HBV相关性肝硬化组-0.260.26-0.330.16

3 讨论

HBV相关性肝病是以肝组织炎性细胞浸润或肝组织纤维化为特征的慢性感染性疾病，特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)参与对HBV的清除作用。对慢性乙型肝炎患者循环血研究发现，CCL2、CCL5、CXCL10等表达水平升高明显，并且随着肝组织炎症好转，趋化因子表达水平可降至正常。肝组织纤维化是HBV相关性肝病慢性化后的共同病理过程，如肝纤维化得不到有效控制可引起肝硬化。有研究表明[6]，趋化因子一方面通过召集炎性细胞聚集，诱导激活、增殖肝星状细胞，另一方面抑制纤维蛋白溶解酶活性，阻止肝细胞外细胞基质或纤维组织分解，导致肝纤维化形成、肝硬化的发生发展。HBV相关性肝细胞癌是肝组织中常见的恶性肿瘤，乙肝肝细胞癌本质上是肝组织炎症反复刺激与持续发生与基因突变的结果之一，同时也是趋化因子召集炎性细胞聚集后对肝组织长期损伤的结果。肿瘤细胞产生的趋化因子能够驱化免疫细胞到肿瘤部位参与宿主特异性抗肿瘤反应，同时产生的趋化因子又能激活肿瘤炎症的发生，从而发生趋化因子介导下的恶性循环[7]。

本研究结果显示，慢性乙型肝炎患者轻、中、重度组循环血CCL2、CCL5、CXCL10的表达水平与乙肝病毒携带者、健康对照组相比较，呈显著升高，慢性乙型肝炎患者重度组水平最高，五者间比较，F值分别为824.90，595.51，810.41，差异有统计学意义(P<0.01)，且随着炎症程度的加重而表达水平升高明显，表明3种趋化因子在肝组织中有重要的炎症调控作用。CCL2是肝脏炎症发生起的始因子，张浩等[8]研究表明CCL2驱化巨噬细胞和单核细胞进入肝细胞内，清除乙肝病毒的同时诱导肝组织炎症反应的发生与持续，并且还可反应肝组织炎症及纤维化程度，这与本实验结果相符。CCL5是另一种常见的趋化因子，它主要表达于肝星状细胞，当CCL5与肝星状细胞上的受体CCR5结合时激活肝星状细胞，诱发肝组织纤维化的发生。Zimmermann等[9]研究发现CCR5可以通过PI3K及氧化还原途径来促进肝星状细胞迁徙，在使用CCR5抑制剂或CCL5受体拮抗剂可明显改变肝组织纤维化程度[10]。同时本研究发现，CXCL10随着慢性乙型肝炎炎症程度加重其表达水平增加明显，表明CXCL10也参与了肝组织炎症的发生、发展。HBV感染肝细胞后，刺激肝细胞或肝脏血管内皮细胞表达大量的趋化因子CXCL10，同时CXCL10刺激受体CXCR3，使表达CXCR3的T细胞转移到感染后的肝细胞，诱导肝细胞的损伤与炎症反应的发生。有学者通过免疫组织化学法检测CHB患者的CXCL10及CXCR3，发现两者含量的增加是预测肝组织纤维化程度的独立危险因素[11]。在分析HBV相关性肝病患者间循环血CCL5、CCL2、CXCL10表达水平差异时发现，循环血CCL2、CCL5、CXCL10的表达水平间差异具有显著的统计学意义(P<0.05)，在HBV相关性肝病患者间，随着病情加重其循环血CCL5、CCL2、CXCL10表达水平呈逐渐升高趋势，且重型乙型肝炎组表达水平最高，显示在肝组织炎症加重时，趋化因子的表达水平同样增加明显。本研究发现，HBV相关性重型肝炎及HBV相关性肝癌组的CCL2、CCL5、CXCL10峰度最高，作者认为可能与HBV相关性重型肝炎发生时，大量肝细胞坏死的同时释放大量的的CCL2、CCL5、CXCL10，同时诱导TB淋巴细胞聚集在肝组织处，加重肝细胞损伤，以此形成恶性循环。但在肝脏癌症发生时，癌细胞旁的巨噬细胞等通过释放大量的IL-10、生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)等细胞因子，干扰正常的抗肿瘤免疫，最终引起肿瘤细胞大量生长[12]，同时肝癌细胞分泌大量的CCL2、CCL5、CXCL10趋化因子，这些驱化因子又可驱化免疫细胞来清除癌细胞。

HBV感染肝细胞后，肝脏免疫系统被激活，大量的CCL2、CCL5、CXCL10等趋化因子被释放，诱发系列免疫反应、肝组织发生炎症损伤。因此HBV-DNA载量与趋化因子表达水平、各个趋化因子之间有着千丝万缕的关系。本研究发现，慢性乙型肝炎组患者 HBV-DNA载量与CCL2、CCL5、CXCL10成明显的正相关(P<0.05)，这符合王亚东等[13-14]的研究结果。同时，王亚东等[13]研究发现，慢性乙型肝炎患者循环CXCL10在乙肝患者的免疫耐受期、清除期，以及重度肝炎期呈依次升高趋势，重度肝炎期升高最显著。Zhou等[15]学者研究发现，HBx能使核因子NF-KB发生错位，从而使CCL2、CCL5、CXCL10等趋化因子基因的启动子区域-122到-133段与NF-KB结合，诱导促进了趋化因子转录。同样在慢性乙型肝炎组，CCL2、CCL5与CXCL10成明显的正相关(r值0.88，P<0.05)，但重型肝炎组、肝硬化组、肝癌组趋化因子与HBV DNA、趋化因子间无明显相关性，这可能与在肝脏疾病慢性化、纤维化后期，趋化因子的释放产生与HBV的刺激、肝细胞不断的坏死与再生、宿主免疫功能差异等有关，但HBV与趋化因子的相互作用机制、趋化因子之间相互关系究竟如何，尚需进一步研究。

综上，虽然趋化因子已被发现与HBV相关性肝病关系密切，但其在HBV感染后机体免疫应答调节机制中的具体方式与功能；在HBV感染慢性化、重症化、纤维化及肝细胞癌变等具体机制；趋化因子及其受体之间以及趋化因子之间的调控机制等方面都有待进一步探索。此外，趋化因子抑制剂、拮抗剂有可能成为治疗HBV相关性肝病的一种新途径。