檞皮素在非小细胞肺癌中的应用研究

张莉莉，谷俊，董媛

(1.西电集团医院呼吸血液肿瘤科，陕西 西安 710077；2.陕西中医药大学附属医院呼吸二科，陕西 咸阳 712000；3.西安交通大学医学院附属红会医院控感办，陕西 西安 710054)

目前，全世界的肺癌发病率及死亡率均高居不下，且发病率一直呈上升趋势。我国属于肺癌的高发国家[1-2]，发病人群主要为老年人，年龄大部分集中在65～75岁[3]，每年因肺癌死亡的人数占全部恶性肿瘤死亡人数的20%～25%[4]，其中因非小细胞癌死亡的人数占所有肺癌死亡人数的80%[5]。因此，为提高肿瘤的临床诊断技术，对肿瘤发生的分子机制和发现特异的肿瘤相关分子必须予以高度关注。然而，目前非小细胞肺癌的发生发展的具体环节及机制尚未完全清楚。

檞皮素是一种具有多种生物活性且无毒副作用的黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜及中草药中。黄酮类化合物是中药的有效成分，具有活血化瘀的功效。因此推测檞皮素对肺癌的治疗可能有一些功效。此外，檞皮素还具有较强的抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖的作用[6-7]。近年来，研究发现檞皮素的药理作用广泛[8]，对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用，其抗肿瘤活性越来越引起研究者的关注。因此，本研究拟通过非小细胞肺癌细胞体外培养来研究檞皮素对其活性的影响机制，为非小细胞肺癌的治疗提供可能的参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本采集

临床标本来源于2016年3月至2018年10月武汉协和医院胸外科接受外科手术治疗的非小细胞肺癌患者44例。纳入标准：有详细的临床病理资料；临床样本均经过两名有经验病理医师诊断确认；病理分型为鳞癌和腺癌；患者均为初次治疗，术前均未接受放疗和化疗。排除标准：认知功能障碍者；合并其他严重的心肝肺功能障碍、肿瘤者；免疫缺陷者。其中男性26例，女性18例，平均年龄(55.6±7.0)岁；鳞癌20例、腺癌24例；TNM分期为I期13例、II期19例、III期7例、IV期5例。取手术中的病理组织，原代分离细胞，常规培养，检测非小细胞肺癌细胞中miR-16和HOXA10表达情况，观察檞皮素对非小细胞肺癌细胞活力的影响。

1.2 miRNA-16和HOXA10的检测

采用TriZol试剂提取各临床分期的非小细胞肺癌细胞中的总RNA，采用实时定量PCR法检测细胞中miRNA-16和HOXA10的表达。

1.3 细胞活力检测

采用CCK-8法检测转染细胞的活力。将细胞以每孔2×103个细胞接种于96 孔板上，于37 ℃及5% CO2恒温培养箱中培养，待药物作用后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在酶标仪上检测450 nm波长处的吸光度(A)值，实验重复3次，计算各组细胞的存活率。

1.4 檞皮素对非小细胞肺癌细胞活力的影响

参照文献报道[1]，采用50 μmol/L的檞皮素作用于非小细胞肺癌细胞48 h后，分别检测作用前后miRNA-16和HOXA10表达和细胞活力变化。

1.5 檞皮素对非小细胞肺癌细胞凋亡率的影响

50 μmol/L檞皮素作用48 h后，每孔加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，立即经流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 不同临床分期的非小细胞肺癌细胞中miRNA-16和HOXA10的表达水平比较

非小细胞肺癌细胞中miRNA-16和HOXA10的表达水平随着患者的临床分期增加而不断增加，差异具有统计学意义(P<0.001)。见表1。

组别Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)miRNA-160.124±0.060.236±0.06∗0.454±0.08∗#0.634±0.10∗#△HOXA100.187±0.040.332±0.05∗0.632±0.09∗#0.823±0.11∗#△

*P<0.01，与Ⅰ期比较；#P<0.01，与Ⅱ期比较；△P<0.01，与Ⅲ期比较。

2.2 檞皮素作用于不同临床分期的非小细胞肺癌细胞后细胞中miRNA-16和HOXA10的表达水平

在檞皮素作用下，非小细胞肺癌细胞中miRNA-16和HOXA10的表达水平在各组临床患者中均有所下降，且与作用前相比差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

时期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)miRNA-16作用前0.124±0.060.236±0.060.454±0.080.634±0.10miRNA-16作用后0.083±0.08∗0.132±0.05∗0.258±0.09∗0.442±0.09∗HOXA10作用前0.187±0.040.332±0.050.632±0.090.823±0.11HOXA10作用后0.114±0.02∗0.237±0.04∗0.455±0.06∗0.671±0.09∗

*P<0.01，与作用前比较。

2.3 檞皮素作用下不同临床分期的非小细胞肺癌细胞活性变化

细胞活力测试显示，檞皮素作用后临床Ⅰ期-Ⅳ期细胞存活率均显著低于作用前(P<0.05)。见表3。

时期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)作用前101.41±6.42114.50±10.51139.20±11.90155.15±15.32作用后78.31±6.21∗81.67±8.19∗90.91±12.54∗100.32±12.53∗

*P<0.01，与作用前比较。

2.4 檞皮素对非小细胞肺癌细胞凋亡率的影响

檞皮素作用后临床Ⅰ期-Ⅳ期非小细胞肺癌细胞凋亡率均显著高于作用前(P<0.05)。见表4。

时期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)作用前5.89±1.125.78±1.155.79±1.345.88±1.25作用后12.56±4.07∗13.21±4.13∗13.65±4.16∗15.34±4.21∗

*P<0.01，与作用前比较。

3 讨论

目前非小细胞肺癌的治疗手段主要以手术、放疗、化疗和靶向治疗为主，非小细胞肺癌在临床上最为常见，发病率和死亡率均居高不下，但发病机制目前尚不明确，因此，为减轻患者放化疗的不良反应，延长患者的生存期，有中医医师提出以辨证论治为基础，运用中医药的方法来有效控制肺癌疾病的进展[9]。许玲等[10]应用人肺腺癌LAX-83裸小鼠模型观察益肺抗瘤饮(主要含黄芪、北沙参、天冬、女贞子、七叶一枝花等)对肺癌细胞增殖的抑制作用，发现益肺抗瘤饮可降低Ki-67的阳性率，并降低C-myc蛋白的表达，益肺抗瘤饮可通过改变肺癌基因表达来抑制肺癌细胞的增殖。檞皮素作为一种黄酮类的中草药有效成分，其对肺癌的作用机制还尚未彻底阐明。

目前，很多研究表明檞皮素对多种肿瘤细胞均存在一定的抑制作用，具有抗炎、抗氧化、扩张血管作用，其抗肿瘤的活性得到了广泛的关注[11]。自然界中具有丰富的檞皮素资源，主要以糖苷的形式存在于植物中，含量丰富，且檞皮素的药理作用广泛而强大，存在于蔬菜、水果及中草药之中，便于提取，分离和利用[12]。在抗肺癌的研究中，发现檞皮素能够促进肺癌细胞NCL-H460凋亡，且随着药物的浓度增加凋亡率也在增加[13]，说明檞皮素在肺癌细胞的凋亡中发挥着重要作用，可能与激活下游的信号通路有关。miR-16作为一种与肿瘤发生密切相关的miRNA，位于DLEU2基因的内含子区域，其低水平能够抑制肿瘤的迁移和侵袭，是肺癌患者预后的独立危险因素[14]。胃癌、乳腺癌、胰腺癌等中均可见miR-16的表达下调[15]。HOXA10是同源盒(HOX)基因家族中的一员，在调节癌症的发生发展中起到了重要的作用。目前的研究发现乳腺癌、子宫内膜癌、口腔癌等多种癌组织中均有HOXA10的过度表达[16]。因此，本研究将miR-16和HOXA10作为非小细胞癌检测的标记物。

本次研究结果显示，在非小细胞肺癌Ⅰ期-Ⅳ期患者中，miR-16和HOXA10的表达水平随着患者的临床分期增加而不断增加，说明miR-16和HOXA10的表达水平与疾病的严重程度呈正相关。提示非小细胞肺癌的发生与miRNA-16和HOXA10的过度表达有关。在檞皮素作用下，非小细胞肺癌细胞中miR-16和HOXA10的表达水平在各组临床患者中均显著低于作用前，说明檞皮素能够抑制miR-16和HOXA10的表达。檞皮素作用后临床Ⅰ期-Ⅳ期非小细胞肺癌细胞存活率显著低于作用前临床Ⅰ期-Ⅳ期细胞存活率，且Ⅰ期-Ⅳ期非小细胞肺癌细胞凋亡率均显著高于作用前。表明檞皮素能够抑制非小细胞肺癌肿瘤细胞的细胞活力，促进非小细胞肺癌癌细胞的凋亡，而这一作用可能是通过抑制miR-16和HOXA10的表达完成，推测可能是由于檞皮素通过调控miR-16/HOXA10轴抑制了非小细胞肺癌细胞的活性。本研究结果也提示，miR-16和HOXA10可能是一种抑癌基因，与在其它系统的肿瘤疾病的研究结果一致。

综上所述，非小细胞肺癌细胞中miR-16和HOXA10的表达水平随着患者的临床分期增加而升高。檞皮素能够有效抑制miR-16和HOXA10的表达，对各个时期非小细胞肺癌细胞均有抑制效果。檞皮素能够降低抑制非小细胞肺癌细胞的活性，增加其凋亡率。因此miR-16和HOXA10的表达水平异常升高可能是非小细胞肺癌发病中的重要环节之一。

本研究存在一定的不足，非小细胞肺癌占肺癌的大多数，细胞类型也很多，但此次研究所涉及的细胞类型较单一，而且 miRNAs是一大类RNA，其所能调控的靶mRNA也纷繁复杂，需要进一步研究，如多种类型的纳入，更多病例的检测及进一步临床验证等。