紫薯花青苷定性分析及其主要花青苷的制备与抗氧化活性研究

韩豪，刘明慧，赵洋洋，刘洛乐，陈志远，祁珊珊，梁引库

1(陕西理工大学，陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中，723001) 2(宝鸡市农业科学研究所，陕西 宝鸡，721000)3(陕西理工大学，维生素D生理与应用研究所，陕西 汉中，723001)

紫薯因富含花青苷而呈现紫色，花青苷不但具有鲜艳的色泽，还具有抗氧化、抗癌和抗炎等生物学活性[1-4]。自然界中花青苷主要有6大类500多种，基本结构为3,5,7-三羟基-2-苯基并吡喃，化学性质不稳定，A环上3,5碳位易与酚羟基、有机酸或糖形成醚键、苷键或发生酰基化反应，成苷的糖类主要有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖等单糖，还有芸香糖和槐糖等二糖类，有机酸通过糖的酯酰结合形式存在，酰基化最常见的酸为咖啡酸、对羟基甲苯酸、芥子酸、阿魏酸和丙二酸等[5-9]。

据文献报道，紫薯花青苷有矢车菊素、芍药素和天竺葵素三类，主要为酰基花青苷[10-12]。紫薯花青苷的主要纯化方法有溶剂萃取法、超滤法、大孔树脂柱层析法和制备液相法[13-16]，前3种方法难以获得高纯度花青苷，制备液相法可以获得高纯度的花青苷，但是产量太低，加工成本较高，无法满足花青苷生物活性的研究。由于紫薯花青苷种类较多，且纯化技术不成熟，标准品较少，尤其是酰基花青苷标准品，从而制约了酰基花青苷的结构鉴定、以及酰基花青苷生物活性和药理学研究，使得紫薯花青苷的研究主要以粗提物为主[17-20]。

本研究拟采用超高效液相色谱—三重四级杆串联质谱联用技术对紫薯花青苷进行定性分析，并筛选出一套高效、低成本和污染小的纯化技术对紫薯主要花青苷进行分离纯化，并初步对其进行抗氧化活性评价。以期为解决酰基花青苷单体的定性、生物活性和药代动力学研究的瓶颈问题提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

紫薯(秦紫薯1号)，杨凌金薯种业有限公司。维生素C(Vc)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu)、飞燕草素-3-葡萄糖苷(Dp-3-glu)和芍药素-3-葡萄糖苷(Pn-3-glu)标准品，标准品的含量均≥98%，Sigma公司。

1.1.2 主要试剂

色谱纯甲酸、乙腈和甲醇，霍尼韦尔公司；福林酚和DPPH，上海源叶生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

ACQUITY TQD超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪，美国waters；玻璃层析柱，江苏三爱斯科学仪器有限公司；UV2550紫外可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；IKA旋转蒸发仪，德国艾卡公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫薯花青苷粗提物的制备

将1 kg新鲜紫薯去皮后，切成厚度2～4 mm，于45 ℃下鼓风干燥，粉碎后过筛40目分子筛，得到120 g紫薯粉，加入体积分数60%乙醇溶液1 000 mL，常温超声提取60 min，重复操作2次，合并所得上清液，离心，用旋转蒸发仪，将上清液浓缩至小体积，采用低温冷冻干燥后，得到紫薯花青苷粗提物21.6 g，放置于-18 ℃保存，备用。

1.2.2 定性和定量方法

UPLC-MS/MS的色谱和质谱参数，采用文献[21]中色谱和质谱参数。

准确称取5 mg冻干的样品，用体积分数6%甲酸水溶液溶解，并定容于25 mL的容量瓶中，再用0.2 μm的针头过滤器过滤，于UPLC-MS/MS测定。

采用超高效液相色谱柱分离，在530 nm处检测，质谱中的全扫描、多反应检测模式、子离子扫描和母离子扫描等扫描方式，确定待测物的质荷比、准分子离子和特征碎片离子，再与文献比对，从而对样品进行初步的定性分析。

以芍药素-3-葡萄糖苷为标准品，采用外标法对不同柱层析方法纯化后的样品进行定量分析。准确称取9.60 mg的芍药素-3-葡萄糖苷标准品，用6%甲酸水溶液定容于25 mL的容量瓶，得到384 μg/mL的标准母液，将该溶液经过逐级稀释，可得到质量浓度19.2、38.4、57.6、76.8和96 μg/mL芍药素-3-葡萄糖苷标准溶液，采用UPLC-MS/MS检测。

1.2.3 紫薯中主要花青苷的制备

称取紫薯花青苷粗提物100 mg，置于活化后的AB-8大孔树脂柱上，分别用2 000 mL纯水、800 mL 20%乙醇、800 mL 40%乙醇和500 mL 60%乙醇洗脱，收集40%乙醇和60%乙醇洗脱的溶液，浓缩后，采用低温冷冻干燥后，命名为AB-8-1；再采用聚酰胺玻璃层析柱对其进行纯化，用2 000 mL无水乙醇溶液、1 000 mL 80%乙醇溶液洗脱，收集80%乙醇的部分洗脱液，浓缩并冷冻干燥后，命名为PA-1；最后采用葡聚糖凝胶玻璃层析柱进一步纯化后，命名为Sep-1。采用UPLC-MS/MS对其进行定性和定量分析。

1.2.4 紫薯花青苷的抗氧化活性检测

1.2.4.1 还原能力检测

分别称取紫薯花青苷粗提物、AB-8-1、Sep-1和芍药素-3-葡萄糖苷各5 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL。分别量取800 μL样品溶液和甲醇(空白)于比色管中，并加入3 mL稀释10倍的福林酚试剂和3 mL 60 g/L NaHCO3溶液混合。在35 ℃水浴90 min后，在750 nm处使用紫外可见分光光度计检测吸光度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基活性检测

DPPH乙醇溶液配制：取0.020 g DPPH溶于无水乙醇中，定容至250 mL，避光保存。

分别称取紫薯花青苷粗提物、AB-8-1、Sep-1、芍药素-3-葡萄糖苷和维生素C各5 mg，以体积分数50%的乙醇为溶剂，溶解并定容于50 mL容量瓶中。分别取编号为1、2、3三只试管，向1号管中加入3 mL 50%的乙醇溶液和3 mL DPPH乙醇溶液，命名为A1，向2管中加入3 mL样品溶液和3 mL无水乙醇溶液，命名为A2，3号管中加入3 mL样品溶液和3 mL DPPH乙醇溶液，命名为A3，摇匀后，避光放置30 min，在517 nm下测定吸光值。做3个平行样，计算平均值和标准偏差。DPPH自由基清除率的计算见公式(1)：

(1)

2 结果与分析

2.1 紫薯花青苷的主要成分分析

通过超高效液相色谱柱对紫薯花青苷粗提液进行分离，并用PDA检测器在530 nm处进行测定，可得其主要花青苷有12种，如图1所示。

图1 紫薯花青苷粗提物色谱图Fig.1 Chromatography of anthocyanins in purple sweet potato crude extracts

以矢车菊素类m/z287的特征离子峰，进行母离子扫描，结合530 nm处检测到的色谱图，得到5个矢车菊素类花青苷，保留时间分别为3.50 min(m/z449)、4.54 min(m/z949)、5.35 min(m/z935)、5.42 min(m/z1055)和5.80 min(m/z1111)。准分子离子[M]+为m/z449，特征碎片离子峰m/z287，通过标准品比对准确定性该化合物为矢车菊素-3-葡萄糖苷。

准分子离子m/z949，特征碎片离子峰m/z787、m/z449和m/z287。碎片离子m/z787，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子m/z449，[M-(176+324)]+即丢失了1个阿魏酰-槐糖苷；碎片离子m/z287，[M-(176+324)-162]+即丢失了1个3号位的阿魏酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为矢车菊素-3-(阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

准分子离子m/z935，特征碎片离子峰m/z773、m/z449和m/z287。碎片离子m/z773，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子449，[M-(162+324)]+即丢失了1个咖啡酰-槐糖苷；碎片离子287，[M-(162+324)-162]+即丢失了1个3号位的咖啡酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为矢车菊素-3-(咖啡酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

准分子离子m/z1 055，特征碎片离子峰m/z893、m/z449和m/z287。碎片离子m/z893，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子m/z449，[M-(162+120+324)]+即丢失了1个咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷；碎片离子m/z287，[M-(162+120+324)-162]+即丢失了1个3号位的咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为矢车菊素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

准分子离子m/z1 111,特征碎片离子峰m/z949、m/z449和m/z287。碎片离子m/z949，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖苷；碎片离子m/z449，[M-(162+176+324)]+即丢失了咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷；碎片离子m/z287，[M-(162+176+324)-162]+即丢失了1个3号位咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖苷。推测其结构为矢车菊素-3-(咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

以芍药素类m/z301的特征离子峰，进行母离子扫描，结合530 nm处检测到的色谱图，得到芍药素类花青苷6个，保留时间分别为4.13 min(m/z463)、4.22 min(m/z907)、5.11 min(m/z963)、6.04 min(m/z949)、6.18 min(m/z1069)和6.75 min(m/z1125)。

准分子离子[M]+为m/z463，特征碎片离子峰m/z301，通过标准品比对准确定性该化合物为芍药素-3-葡萄糖苷。

准分子离子[M]+为m/z907，特征碎片离子峰m/z745、m/z463、m/z301，碎片离子m/z745，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子463，[M-(120+324)]+即丢失了1个对-羟基苯甲酰-槐糖苷；碎片离子301，[M-(120+324)-162]+即丢失了1个3号位的对-羟基苯甲酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为芍药素-3-(对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

准分子离子[M]+为m/z963，特征碎片离子峰m/z801、m/z463、m/z301，碎片离子m/z801，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子463，[M-(176+324)]+即丢失了1个阿魏酰-槐糖苷；碎片离子301，[M-(176+324)-162]+即丢失了1个3号位的阿魏酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖，推测其结构为芍药素-3-(阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

准分子离子[M]+为m/z949，特征碎片离子峰m/z787、m/z463、m/z301，碎片离子m/z787，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子m/z463，[M-(162+324)]+即丢失了1个咖啡酰-槐糖苷；碎片离子m/z301，[M-(162+324)-162]+即丢失了1个3号位的咖啡酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为芍药素-3-(咖啡酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

准分子离子[M]+为m/z1 069，特征碎片离子峰m/z907、m/z463、m/z301，碎片离子m/z907，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子463，[M-(120+162+324)]+即丢失了1个咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷；碎片离子m/z301，[M-(120+162+324)-162]+即丢失了1个3号位的咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷(Pn-3-[caf-(p-cou)-sop]-5-glu)。

准分子离子[M]+为m/z1 125，特征碎片离子峰m/z963、m/z463、m/z301，碎片离子m/z963，[M-162]+即丢失了1个葡萄糖；碎片离子m/z463，[M-(162+176+324)]+即丢失了1个咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷；碎片离子m/z301，[M-(162+176+324)-162]+即丢失了1个3号位的咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷和1个5号位葡萄糖。推测其结构为芍药素-3-(咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷)-5-葡萄糖苷。

以飞燕草素类m/z303的特征离子峰，进行母离子扫描，结合530 nm处检测到的色谱图，得到1个飞燕草素类花青苷，保留时间分别为3.17min。从其对应质谱图，得到准分子离子[M]+为m/z465，特征碎片离子峰m/z303，通过标准品比对，可得该化合物为飞燕草素-3-葡萄糖苷。

综上所述，经检测，紫薯中共含3类12种花青苷类物质，如表1所示。

表1 紫薯花青苷的定性结果Table 1 Qualitative results of anthocyaninsin purple sweet potato

2.2 紫薯中主要花青苷的纯化

通过对紫薯花青苷的定性分析，紫薯主要花青苷的保留时间为6.18 min，经过初步定性分析为芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷。以芍药素-3-葡萄糖苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标拟合标准工作曲线，回归方程Y=7.381 1X-178.5(R2=0.999 86)。通过计算可得紫薯花青苷粗提液、AB-8-1和Sep-1中芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷的含量分别为38.9%、83.1%和98%。

2.3 紫薯主要花青苷抗氧化活性

由表2可知，芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷含量38.9%、83.1%和98%的3个样品，其还原力分别为0.256、0.402和0.611，芍药素-3-葡萄糖苷和Vc的还原能力为0.485和0.633。清除DPPH自由基能力分别为9.54%、34.2%和74.9%，芍药素-3-葡萄糖苷和Vc清除DPPH自由基能力分别为45.5%和77.4%。还原力和清除DPPH自由基能力与芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷含量呈正相关，因此可初步判定紫薯主要抗氧化成分为花青苷类化合物。相同含量的芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷的抗氧化活性比对，得到相同苷元的酰基花青苷的活性高于非酰基花青苷，可见咖啡酸和对羟基苯甲酸有提高其酰基花青苷抗氧化活性的作用，且芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷的还原力和清除DPPH自由基能力接近Vc，可见该化合物具有较高的抗氧化活性。

表2 不同含量花青苷的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of anthocyanins in different contents

3 结论

本实验从紫薯中检测出3类12种花青苷类物质，其苷元分别为飞燕草素、矢车菊素和芍药素，其中飞燕草素类花青苷未见报道，在秦紫薯1号中未检出天竺葵素类花青苷[10-12]。飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷通过标准品准确定性分析，其余9种为酰基花青苷，葡萄糖、槐糖是主要糖苷，阿魏酸、对-羟基苯甲酸和咖啡酸3种有机酸与槐糖发生酰基化反应。

经过柱层析法，AB-8大孔树脂、聚酰胺和葡聚糖凝胶3种填料连用方法对紫薯中主要花青苷进行纯化，芍药素-3-(咖啡酰-对羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷经纯化后含量可达98%。本实验所采用的大孔树脂、聚酰胺、葡聚糖凝胶联用技术纯化花青苷类化合物，具有含量高、成本低和污染小的特点。

采用福林酚试剂法和清除DPPH自由基法，对比研究了不同层析填料纯化后花青苷的抗氧化活性，结果表明，紫薯样品中芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷的纯度与抗氧化活性呈正相关，表明紫薯样品的抗氧化活性主要是紫薯花青苷在起作用。相同含量的芍药素-3-(咖啡酰-对-羟基苯甲酰-槐糖苷)-5-葡糖苷和芍药素-3-葡糖苷的抗氧化活性比对，得到相同苷元的酰基花青苷的活性高于非酰基花青苷，可见咖啡酸和对羟基苯甲酸有提高其酰基花青苷的抗氧化活性的作用。由于紫薯花青素具有多个酚羟基，且含有多个酰化基团，酰基化花青素结构中的弧对电子可以作为氢供体，因而具有清除活性氧自由基的能力，从而表现出较强的抗氧化性能[17-20]。糖苷键有利于提高花青苷的稳定性，酰基花青苷与非酰基花青苷相比具有结构稳定，抗氧化活性强的特点[22-26]，紫薯花青苷主要为酰基花青苷，因此在食品加工和保健品领域具有广泛的开发和应用前景。