矶海绵共生真菌代谢产物抑菌活性初步研究

郑双芝，李晓菡，吴丹丹，陈怡怡，卢甜甜，周紫芳，白雪莲

（杭州师范大学 生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036）

海绵是最原始的多细胞动物，属于海洋中营固着生活的一类动物。近年来，研究者从海绵体内发现许多可为医药素材的抗菌、抗病毒、抗肿瘤物质，因此海绵具有良好的研究价值[1-2]。与传统的化学合成抗菌药相比，生物抗菌药具有安全性高、抗菌效果好等特点。海绵共生菌的代谢产物中含有大量的抑菌活性物质，其中很多均未开发，具有很好的研究前景。试验通过对矶海绵共生真菌代谢产物的体外抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、恶臭假单胞菌 （Pseudomonas putida）、白色念珠菌（Candida albicans）、 小麦纹枯病菌 （Rhizoctonia cerealis） 4株致病菌的研究，筛选出抑菌活性强的共生真菌，为矶海绵共生真菌的开发与利用奠定基础[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

矶海绵共生真菌 （Y3， Y4， Y5， J5， J6， J7，G7，G2），杭州师范大学天然防腐剂研究实验室保存；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)、白色念珠菌（Candida albicans） 、 小麦纹枯病菌 （ Rhizoctonia cerealis） ，中国微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 试剂

PDA培养基、PDB培养基、乙酸乙酯（分析纯）、二甲基亚砜（DMSO，色谱纯） 等，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 共生真菌代谢产物制备

将8株矶海绵共生真菌分别接种于500 mL PDB液体培养基中，于28℃，140 r/min条件下振荡培养7 d，离心（8 000 r/min，10 min），取上清液用等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，旋转蒸发浓缩至干，用DMSO溶解，分别配制成100，10，1 mg/mL 3个质量浓度，备用[4]。

1.2.2 抑菌活性试验

采用96孔板法，将病原菌分别接种于PDB培养基中，在28℃恒温摇床培养12 h。用无菌PDB培养基将上述发酵液细胞总数稀释至105个/mL，采用96孔板法进行抑菌活性测定。每孔分别加入90μL的病原菌，再加入10μL不同质量浓度共生真菌代谢产物（100，10，1 mg/mL）。在28℃下培养12 h，使用酶标仪测定每孔OD值，计算抑制率R=[（OD值空白组-OD值样品组） /OD值空白组]×100%。金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌2种病原菌OD值测定波长为495 nm，阳性对照为青霉素；白色念珠菌和小麦纹枯病菌OD值测定波长为630 nm，阳性对照为两性霉素，以DMSO为空白组。每组做3个平行[5]。

2 矶海绵共生真菌抑菌活性研究

矶海绵共生真菌代谢产物复杂，采用乙酸乙酯相进行萃取后，对其抑菌活性进行研究，革兰氏阴性菌恶臭假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、酵母菌白色念珠菌和霉菌小麦纹枯病菌为测试菌株，研究发现其代谢产物不同，抑制致病菌种类亦不同，抑制效果具有显著性差异。

矶海绵共生真菌代谢产物对恶臭假单胞菌的抑制率见表1。

恶臭假单胞菌为革兰氏阴性菌，常从腐败的鱼中检出，是食品中存在的一种条件致病菌。由表1可知，菌株Y3代谢产物对恶臭假单胞菌抑制作用较强，当Y3质量浓度为1 mg/mL时抑制率为51.81%（±0.01），超过了50%，当Y3质量浓度为100 mg/mL时，抑制率达63.09%（±0.03），与10 mg/mL青霉素对恶臭假单胞菌抑制作用相近。当Y4代谢产物质量浓度为100 mg/mL时，抑制率达54.72%±0.04%，抑制作用较强。结果表明，矶海绵共生菌Y3和Y4的代谢产物中含有很强的抑制恶臭假单胞菌活性的化合物，需进一步分离和纯化。

表1 矶海绵共生真菌代谢产物对恶臭假单胞菌的抑制率 /%

矶海绵共生真菌代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑制率见表2。

表2 矶海绵共生真菌代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑制率/%

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌的代表。其致病力强弱主要取决于其产生的毒素，中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品[6]。此外，油煎蛋、凉粉等引起的中毒事件也有报道。由表2可知，菌株Y3，Y4，J5，G2代谢产物对金黄色葡萄球菌有抑制活性，且抑制率与菌株Y3，G2代谢产物浓度呈正相关性。J6，J7，G7，Y5，抑制作用不强或无抑制作用。其中，菌株G2代谢产物（质量浓度为100 mg/mL）对金黄色葡萄球菌抑制率最高为48.10%±0.03%，菌株Y3代谢产物（100 mg/mL）对金黄色葡萄球菌抑制率为45.475±0.82%。

矶海绵共生真菌代谢产物对白色念珠菌的抑制率见表3。

白色念珠菌又称白假丝酵母菌，易污染食品，尤其是长期室温放置的剩菜、剩饭等。由表3可知，菌株J6，G7，Y5的代谢产物对白色念珠菌有显著抑制效果，其中菌株G7和菌株Y5抑制率最高，分别为50.82%±0.03%和43.94%±0.52%，抑制作用接近1 mg/mL两性霉素，且与代谢产物质量浓度呈正相关，其抑菌活性物质有待进一步研究。

表3 矶海绵共生真菌代谢产物对白色念珠菌的抑制率/%

矶海绵共生真菌代谢产物对小麦纹枯病菌的抑制率见表4。

表4 矶海绵共生真菌代谢产物对小麦纹枯病菌的抑制率 /%

小麦受纹枯菌侵染后，在各生育阶段出现烂芽、病苗枯死、花秆烂茎等症状，造成小麦大量减产，是导致我国麦区病害的重要真菌。由表4可知，8株矶海绵共生真菌对小麦纹枯病菌抑制作用均较弱，100 mg/mL Y4代谢产物对小麦纹枯病菌抑制率最高，仅为22.09%±0.61%，显著高于1 mg/mL两性霉素，但未表现出质量浓度依赖性。

3 结论

矶海绵共生菌Y3和Y4的代谢产物对恶臭假单胞菌具有很强抑制作用，菌株Y3，Y4，J5，G2代谢产物对金黄色葡萄球菌有抑制活性，且抑制率与菌株Y3，G2代谢产物质量浓度呈正相关性。菌株J6，G7，Y5的代谢产物对白色念珠菌有显著抑制效果，其中菌株G7和菌株Y5抑制率最高，分别为50.82%±0.03%和43.945±0.52%。8株矶海绵共生真菌对小麦纹枯病菌抑制作用均较弱。矶海绵共生菌代谢产物对不同致病菌抑制作用不同，其化学组成有待进一步研究。