QuEChERS-分散固相萃取-气相色谱-质谱法测定牛乳中喹氧灵残留

齐晓茹，苏运聪，李 飞*，李兴佳，张耀广，柴艳兵

（石家庄君乐宝乳业有限公司，农业农村部乳品质量安全控制重点实验室，河北 石家庄 050021）

随着人们生活水平的不断改善，消费者越来越重视食品的营养与健康，对乳制品质量的要求也在不断提高，乳品原料质量与安全问题是行业发展的基础，是乳品消费安全的先决条件[1-3]，因此严把乳制品原料入口关，是当下乳品行业控制产品质量的重要任务。优质的原料乳能够生产出优质的乳产品，原料乳的好坏对产品的影响至关重要。

喹氧灵（quinoxyfen）又名快诺芬、苯氧喹啉，是美国陶氏益农公司近年来新推出的一种喹啉类杀真菌剂[4]。目前，喹氧灵被广泛用于各种禾谷类作物，叶面施药后，药剂可迅速渗入到植株组织中，并向顶端移动，持效期长达70 d[5]。GB 2763.1—2018《食品安全国家标准 食品中百草枯等43 种农药最大残留限量》[6]明确规定，生乳中喹氧灵最大残留限量为0.01 mg/kg。目前，国内外对于喹氧灵检测方法的研究还比较少，Cabras等[7]研究葡萄、葡萄酒及其加工制品中喹氧灵残留量的检测方法；杨方等[8]研究大豆、花椰菜、樱桃、木耳和葡萄酒等基体中喹氧灵残留量的检测方法；Ferri等[9]通过高效液相色谱-质谱联用技术研究喹氧灵的光转化途径；Duncan等[10]通过酶联免疫实验制备喹氧灵分析免疫试剂。对于牛乳中喹氧灵检测方法的研究未见相关文献报道。

QuEChERS是近年来广泛应用于农产品检测的快速样品前处理技术[11-12]，具有方便、高效的优点[13-15]。本研究通过对喹氧灵含量测定的几种前处理技术进行对比分析，采用QuEChERS技术深入研究牛乳中喹氧灵的测定方法，为今后牛乳中喹氧灵检测标准的出台提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳：市售。

喹氧灵标准品（纯度99.80%） 美国Sigma-Alorich公司；N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）填料、C18填料（粒度40～60 μm） 美国Sepax公司；乙腈、正己烷、乙酸乙酯（均为色谱纯）、硫酸镁、氯化钠、无水硫酸镁（均为分析纯） 天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

6850-5975C气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）仪 美国Agilent公司；RE311旋转蒸发仪 日本Yamato公司；TGL-20M离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；MTN-2800W氮吹仪天津奥特赛恩斯仪器有限公司；ENVITM-18固相萃取柱美国Supelco公司；NH2固相萃取柱 美国Sepax公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS条件的优化及标准曲线的建立

配制基质标准工作溶液，设定进样体积为1 μL，对色谱柱的型号和升温程序进行优化，以获取最佳检测效果。在优化GC-MS条件的基础上，选取质量浓度为0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的标准工作溶液，以峰面积为纵坐标，以组分含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理方法优化

1.3.2.1 提取溶剂的选择

按照相似相溶原理，结合样品基质的特性，选取乙腈、乙酸乙酯作为提取剂进行比较。量取15 mL牛乳于50 mL离心管中，分别加入2 种提取溶剂（所有提取溶剂体积均为20 mL）进行提取，加入4 g硫酸镁和1 g氯化钠；5 000 r/min条件下离心5 min后吸取1 mL提取液于试管中，40 ℃条件下氮吹浓缩至干，加1 mL正己烷定容，涡旋混匀后过0.22 μm滤膜，检测回收率。

1.3.2.2 净化条件的选择

固相萃取小柱法：量取15 mL牛乳于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈、4 g硫酸镁和1 g氯化钠；于振荡器上剧烈振荡2 min，在5 000 r/min条件下离心5 min，收集上清液于100 mL旋蒸瓶中，残渣用20 mL乙腈重复提取1 次；离心后，合并2 次提取液，40 ℃水浴旋转蒸发至1 mL左右，待净化；用10 mL乙腈活化ENVITM-18（或NH2）固相萃取柱后，将浓缩的提取液转移至固相萃取柱中，然后每次用5 mL乙腈洗涤样品瓶，洗涤液并入固相萃取柱中，重复此操作2 次；同时收集流出液于100 mL旋蒸瓶中，用10 mL乙腈洗脱固相萃取柱，合并流出液，40 ℃水浴旋转蒸发至近干；用正己烷溶解残渣并定容至1.0 mL，过0.22 μm有机滤膜，供GC-MS仪测定[16]。

QuEChERS法：称取10 g牛乳于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈、4 g硫酸镁和1 g氯化钠；于振荡器上剧烈振荡，在5 000 r/min条件下离心10 min，使乙腈与饱和食盐水分层，取上清液，待净化；将上述获得的溶液转移至预先装有250 mg PSA、500 mg C18和750 mg无水硫酸镁的50 mL离心管中，于振荡器上剧烈振荡，在5 000 r/min条件下离心10 min，取10 mL上清液，于40 ℃水浴条件下氮吹至干，加1 mL正己烷定容，涡旋混匀后，过0.22 μm有机滤膜，供GC-MS仪测定。

1.3.3 方法准确度、精密度和灵敏度评价

准确度、精密度评价：选取3 个不同添加水平的牛乳样品进行加标回收实验，按照所优化的方法进行前处理。用加标回收率评价方法的准确度，用多次检测的加标回收率相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）评价方法的精密度[17]。

灵敏度评价：用空白基质液加标进行上机检测，通过色谱软件分析得到该条件下的信噪比（RS/N），再由此计算出RS/N为10时所对应的目标物含量作为方法的定量限[17]。

1.3.4 市售牛乳样品中喹氧灵含量的检测

按照上述优化出的前处理方法和色谱条件，对收集自75 个不同奶牛养殖户的牛乳样品进行检测。

1.4 数据处理

实验结果采用SPSS 17.0软件进行差异显著性统计分析，显著水平为0.05，采用Origin 7.5软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 GC-MS条件的优化及标准曲线

通过比较Agilent DB-1701、Agilent VF-1701MS与Agilent HP-5MS 3 种色谱柱的分离效果，在同一程序升温条件下，3 种色谱柱所得到的色谱峰均峰形良好，Agilent DB-1701色谱柱所得到的色谱峰响应值明显低于Agilent HP-5MS色谱柱所得到的色谱峰，Agilent VF-1701MS色谱柱次之，因此最终确定色谱条件为：Agilent HP-5MS色谱柱（14%氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温程序：40 ℃保持1 min，然后以30 ℃/min升温至130 ℃，再以6 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min；载气为氦气，纯度≥99.999%，流速1.2 mL/min；进样口温度290 ℃；进样量1.0 μL；进样方式：不分流进样；电子轰击源70 eV；离子源温度300 ℃；四极杆温度180 ℃；GC-MS传输线温度280 ℃；溶剂延迟8 min；选择离子监测模式。

图1 喹氧灵标准品色谱图Fig. 1 Chromatogram of quinoxyfen standard

图2 喹氧灵定量离子、定性离子Fig. 2 Quantitative and qualitative ions of quinoxyfen

由图1～2可知，在上述色谱条件下，喹氧灵保留时间为15.66 min，喹氧灵色谱峰分离效果良好，峰形尖锐而对称，没有杂峰干扰。喹氧灵色谱峰面积与其质量浓度在0.00～1.00 μg/mL范围内时，喹氧灵色谱峰面积与其质量浓度呈线性相关，线性方程为y=4×106x＋63 807，式中：x代表喹氧灵的质量浓度，y代表峰面积，相关系数（R2）为0.998 7，表明线性良好。

2.2 样品前处理方法的确定

2.2.1 提取溶剂的确定

在所选提取溶剂体积一致的情况下，实验结果表明，用乙酸乙酯提取时样品乳化严重，无法准确提取上层清液，不适合用于牛乳中喹氧灵的检测，采用乙腈提取时回收率为（95.0±4.5）%，因此本研究采用乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 净化条件的确定

比较2 种常见的净化方式：固相萃取小柱法（ENVITM-18 packing：12 mL、2 000 mg；NH2柱：500 mg、3 mL）和QuEChERS法（250 mg PSA、500 mg C18和750 mg MgSO4）。按1.3.2.2节进行处理，对牛乳中喹氧灵含量进行加标回收率实验。

表1 不同净化方式的回收率和RSD比较结果Table 1 Recovery and RSD of different purification methods

由表1可知，采用ENVITM-18净化柱所得回收率为70.2%～91.1%，RSD为9.3%，采用NH2净化柱所得回收率为68.3%～80.7%，RSD为5.5%，采用QuEChERS法所得回收率为83.2%～97.2%，RSD为6.3%。

图3 不同净化方式的回收率比较结果Fig. 3 Statistical comparison of recovery results from different purification methods

由图3可知，ENVITM-18净化柱与NH2净化柱所得回收率差异不显著（P＞0.05），采用QuEChERS法的回收率显著高于固相萃取小柱法（P＜0.05）。QuEChERS法操作简单、省时，固相萃取小柱法操作复杂，耗时较

长。实验过程中所用到的乙腈是一种有毒的有机溶剂，如果采用QuEChERS法，检测1 个样品只需要消耗20 mL乙腈，采用固相萃取小柱法需要消耗75 mL乙腈，因此，QuEChERS法可以作为一种较好的检测手段来取代固相萃取小柱法，用于牛乳中喹氧灵的检测。

2.3 方法的准确度、精密度和灵敏度

2.3.1 方法的准确度和精密度

表2 方法的准确度和精密度评价结果Table 2 Accuracy and precision of the method

向不含喹氧灵的牛乳中添加5、10、20 μg/kg 3 种不同水平的喹氧灵标准品，做加标回收实验，每个添加水平做6 次平行实验，同时做2 次空白实验。由表2可知，平均回收率为83.2%～100.8%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中对于回收率的要求。组内RSD为2.1%～4.3%，组间RSD为4.3%，说明该实验方法具有较高的准确度和较好的精密度，可以作为检测牛乳中喹氧灵的方法。被测组分含量＜0.1 mg/kg时，回收率为60%～120%。

2.3.2 方法的灵敏度

当加标量为5 μg/kg（GB 2763.1—2018中规定的喹氧灵限量值0.5 倍）时，喹氧灵的信噪比（RS/N）为19.3（3RS/N为方法检出限，10RS/N为方法定量限）。因此在该加标量下，喹氧灵可在仪器上定量检出，确定出该方法的定量限为5 μg/kg。

2.4 牛乳中喹氧灵含量的测定

取75 个不同奶牛养殖户的牛乳样品进行测定，结果表明，75 个不同奶牛养殖户的牛乳样品中喹氧灵含量均低于GB 2763.1—2018规定的生乳中喹氧灵最大残留限量0.01 mg/kg，可见，目前牛乳中喹氧灵残留量较低，尚符合国家安全标准。

3 结 论

利用QuEChERS法，采用乙腈作为提取溶剂，通过PSA和C18净化样品，建立牛乳中喹氧灵检测方法，该方法简便、快捷、高效、灵敏度高。喹氧灵在牛乳中的回收率为83.2%～100.8%，该方法能够达到灵敏度、准确度和精密度的要求。对75 个奶牛养殖户的生乳进行取样并测定其喹氧灵含量，测定结果均低于限量值，可见，目前生乳中喹氧灵的残留量尚处在一个较为安全的水平。GB 2763.1—2018对生乳中33 种农药最大残留限量做了明确规定，喹氧灵只是其中的一种，今后还应该对其他农药残留的检测方法进行优化研究，以便于更加全面地把控牛乳质量。农业农村部办公厅制定的《奶业品牌提升实施方案》中重点强调将质量作为奶业品牌发展的第一要义，构建覆盖全产业链的质量监管体系和高效安全的生产体系，确保生产出的产品安全优质、经得起消费者检验[18-19]。要强化源头生产管理，完善乳品检测指标和检测方法标准，健全乳品质量安全风险评估制度，及时发现并消除风险隐患[20]。乳品企业应严把乳制品检验关，让消费者购买到放心的乳制品。