高分辨四极杆飞行时间质谱仪判别复原乳和超高温灭菌乳

崔 婧，苏美丞，谭冬飞，张 霞，贾 曼

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

牛乳因其独特的口感和丰富的营养价值深受消费者喜爱。目前市场上出售的液态牛乳主要有巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳，但是，随着牛乳消费量的增加，原料乳供不应求，加之乳粉价格低廉、易于运输的优势，有些不法厂商用乳粉勾兑制成复原乳，冒充超高温灭菌乳而不加标识，极大地损害了消费者的合法权益。另一方面，由于乳粉加热杀菌温度高于超高温灭菌乳，且与超高温灭菌乳相比增加了喷雾干燥这一工艺过程，因此乳粉中的营养物质损失较为严重[1-2]。由于复原乳和超高温灭菌乳的化学成分基本相同，因此判别复原乳和超高温灭菌乳显得尤为困难。为了保障消费者的合法权益，保障牛乳质量，寻找合适的区分复原乳和超高温灭菌乳的方法至关重要。

目前判别复原乳的指标主要集中于糠氨酸[3]、乳果糖[4-6]、羟甲基糠醛、热变性蛋白[7]等美拉德反应产物，相关的检测技术主要有高效液相色谱法[3,8]、离子色谱法[9]、酶比色法[10-11]等。农业农村部新修订的行业标准NY/T 939—2016《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》[12]利用高效液相色谱法和分光光度法，选取糠氨酸和乳果糖作为复原乳的标示物，通过计算乳果糖和糠氨酸的比值来判别超高温灭菌乳和复原乳，该标准的检测方法耗时长、前处理复杂、灵敏度低。Marconi等[13]利用酶比色法测定巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳中乳果糖含量，检测灵敏度较高。但由于糠氨酸、乳果糖含量不仅受加热温度影响，而且还受到贮藏时间的影响[4,14-15]，因此，仅靠糠氨酸、乳果糖2 个指标判别超高温灭菌乳和复原乳往往容易造成误判。在这种情况下，寻找快速、准确判别超高温灭菌乳和复原乳的方法显得尤为重要。

高分辨四极杆飞行时间质谱仪由于具有高灵敏度，能够检测复杂样品中的痕量物质，因此被广泛应用于代谢组学分析[16-18]。化学计量学方法与代谢组学分析结合是目前最为先进的分析技术[19]。Mais等[20]利用超高效液相色谱-四极杆/飞行时间-质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS），采用非靶向代谢组学的方法，建立正交偏最小二乘方差判别分析模型来区分不同地理来源的生姜。Zhao Qiqi等[21]利用高分辨质谱仪结合化学计量学方法，监测到高血脂患者37 种血清代谢物的改变及参与的11 个途径，为高血脂的早期风险评估提供了潜在的生物标志物，并为高血脂患者体内复杂的代谢途径变化提供了进一步的见解。

本研究利用高分辨四极杆飞行时间质谱仪，采用非靶向代谢组学方法，结合化学计量学方法，找到14 种区别超高温灭菌乳和复原乳的差异物质，并建立了区别2 种乳的判别模型，以期通过筛选出的14 种物质建立的判别模型能够快速、准确地判别超高温灭菌乳和复原乳，为复原乳的判别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10 种不同品牌超高温灭菌乳购自北京各大超市，10 种不同全脂基粉采自北京、内蒙古、河北和新西兰。

乙腈（色谱级） 德国Merck公司；乙腈、甲酸（均为质谱级） 美国Fisher Scientific公司；Mili-Q系统美国Milipore公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 6545 高分辨四极杆飞行时间液相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；ST16R高速冷冻离心机美国Thermo Fisher Scientific公司；ME802E称量天平瑞士梅特勒-特利多有限公司；Vortex Genius 3涡旋混合仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 复原乳的配制

按蛋白质质量浓度为3.0 g/100 mL将乳粉溶于63 ℃热水中，手摇均质30 min，配制成复原乳。

1.3.2 样品前处理

吸取2 mL牛乳于15 mL离心管中，8 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，重复3 次；下层转移至新的15 mL离心管中，加入4 mL乙腈，涡旋5 min，10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min；上清液过0.22 µm有机滤膜后，置于进样小瓶中，待测。每个样品6 个平行。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse C18柱（3.0 mm×150 mm，1.8 µm）；流动相：正离子模式下，流动相A为体积分数为0.2%甲酸水溶液，流动相B为体积分数为0.2%甲酸-乙腈；负离子模式下，流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为5 mmol/L乙酸铵-乙腈；正离子模式下梯度洗脱条件为：0～2.5 min、1%流动相B，2.5～8 min、30%流动相B，8～12 min、50%流动相B，12～20 min、95%流动相B，20～25 min、95%流动相B；负离子模式下梯度洗脱条件为：0～1 min、2%流动相B，1～2 min、10%流动相B，2～5 min、65%流动相B，5～7 min、95%流动相B，7～15 min、95%流动相B，15～15.5 min、5%流动相B；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 µL。

1.3.4 质谱条件

正离子模式：电喷雾离子（electrons pray ionization，ESI）源；干燥器温度250 ℃；干燥器流速7 mL/min；鞘气温度325 ℃；鞘气流速11 mL/min；毛细管电压3 000 V；去簇电压180 V；负离子模式：ESI源；干燥器温度320 ℃；干燥器流速8 mL/min；鞘气温度400 ℃；鞘气流速11 mL/min；毛细管电压3 500 V；去簇电压150 V。

1.4 数据处理

利用Mass Hunter Profinder B.06.00 SP1软件（美国安捷伦公司）对Agilent 6545高分辨质谱仪采集的超高温灭菌乳和复原乳样品的色谱峰进行提取、保留时间校准、峰对齐、标准化等预处理，然后进行数据处理。

使用SIMCA-P 14.1软件进行化学计量学分析。将预处理后的数据导入该软件中，使用无监督式主成分分析（principal component analysis，PCA）观察超高温灭菌乳和复原乳的区分情况，进一步使用偏最小二乘方差判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）方法找到区分2 种乳的表征因子。

使用SPSS 21.0软件对超高温灭菌乳和复原乳中各表征因子的含量进行方差分析（analysis of variance，ANOVA），在95%的概率水平上（P＜0.05）进行测试，得出差异显著性结果。

2 结果与分析

2.1 正、负离子模式下超高温灭菌乳和复原乳PCA结果

图1 正、负离子模式下超高温灭菌乳和复原乳的PCA结果图Fig. 1 PCA plots of UHT and reconstituted milk in positive and negative ion modes

基于高分辨质谱积分数据，利用SIMCA-P 14.1软件，对超高温灭菌乳和复原乳2 种乳的积分数据进行无监督式PCA。由图1可知：正离子模式下，主成分1和主成分2的累积贡献率达0.726；负离子模式下，主成分1和主成分2的累积贡献率达0.678。结果表明，通过无监督式PCA，2 种乳得到很好地区分，证明通过2 种乳中的内源性小分子物质可以将其区分开。

2.2 正、负离子模式下超高温灭菌乳和复原乳PLS-DA分析及差异性表征因子筛选

为了找出复原乳和超高温灭菌乳中的差异性物质，将不同质荷比（m/z）下的各峰面积积分结果进行PLSDA分析。由图2可知，通过PLS-DA分析，2 种乳得到很好地区分。

通过变量投影重要性（variable importance，VIP）对区别2 种乳有重要贡献的变量进行筛选。一般来说，当VIP值大于1时，说明该变量对分类有显著贡献。因此，提取VIP值大于1的m/z作为区分2 种乳的表征因子，其中正离子中筛选出7 种表征因子，m/z分别为568.567 5、162.113 3、114.066 9、102.127 6、228.197 0、158.154 4和338.343 9，负离子中筛选出的7 种表征因子，m/z分别为193.036 3、195.051 8、165.041 6、179.058 0、683.231 5、112.052 5和192.067 8，正、负离子模式下VIP结果如图3～4所示。

图2 正、负离子模式下超高温灭菌乳和复原乳的PLS-DA分析图Fig. 2 PLS-DA plots of UHT and reconstituted milk in positive and negative ion modes

图3 正离子模式下VIP柱状图（a）及2 种乳的峰面积积分（b～h）Fig. 3 VIP (a) and peak area integral in UHT and reconstituted milk (b～h) in positive ion mode

图4 负离子模式下VIP柱状图（a）及2 种乳的峰面积积分（b～h）Fig. 4 VIP (a) and peak area integral in UHT and reconstituted milk (b～h) in negative ion mode

表1 正、负离子模式下区分超高温灭菌乳和复原乳的14 种表征因子的方差分析Table 1 Analysis of variance of 14 biomarkers between UHT and reconstituted milk

进一步，利用SPSS 21.0软件对以上筛选出的14 种表征因子进行方差分析。由表1可知，筛选出的14 种表征因子在2 种乳中均有高度显著性差异。因此，利用筛选出的14 种表征因子建立区分超高温灭菌乳和复原乳的判别模型。

2.3 超高温灭菌乳和复原乳PLS-DA判别模型构建

根据上述筛选出的14 种表征因子，建立PLS-DA判别模型。一般来说，评价PLS-DA模型拟合效果的指标主要为R2x、R2y和Q2y，这3 个指标越接近1，则代表该模型的拟合效果越好，而Q2y可以用于评价模型预测能力，Q2y越大，模型预测效果越好[22]。由图5可知，本研究构建的PLS-DA模型，R2x=0.765，R2y=0.934，Q2y=0.893，证明该模型的拟合效果较好，可以很好地判别超高温灭菌乳和复原乳。

图5 超高温灭菌乳和复原乳的二维、三维PLS-DA模型及模型置换验证结果图Fig. 5 2D and 3D PLS-DA models and permutation plot of UHT and reconstituted milk

为了验证模型的有效性，对模型进行置换验证，以避免该PLS-DA模型的过拟合。置换验证结果见图5C。LC-MS检测获得的数据阵经过999 次建模获得的R2y与真实模型的R2y共同构成的回归线截距为0.073 2，经过999 次建模获得的Q2y与真实模型的Q2y共同构成的回归线截距为-0.609 0。理论上，建模获得的Q2y与真实模型的Q2y共同构成的回归线截距不大于0.05，证明所建的判别模型未过度拟合，统计学意义显著[23]。因此，该模型未过度拟合，具有有效性。

3 结 论

由于超高温灭菌乳和复原乳加热杀菌温度相差不大，且部分乳制品企业对牛乳加热杀菌温度控制不严格，容易使超高温灭菌乳产生过热加工[24]，增加复原乳与超高温灭菌乳的判别难度。因此，目前对复原乳的研究主要集中于生乳、巴氏杀菌乳和复原乳的判别，然而对超高温灭菌乳和复原乳判别方法的研究较少。本研究利用高分辨四极杆飞行时间质谱仪，结合化学计量学方法，采用非靶向代谢组学方法，建立一种区分超高温灭菌乳和复原乳的判别模型，该方法既克服了传统方法判别复原乳前处理复杂、耗时长等问题，又提供了一种判别超高温灭菌乳和复原乳的方法，实现了对超高温灭菌乳和复原乳的快速、高效判别，前处理简单、可靠性高。

所得的14 种差异物质有待后续通过采集二级碎片离子峰、匹配标准物质进行定性分析，以便为更好地找出复原乳和超高温灭菌乳中的差异物质打下基础。