吡非尼酮抑制大鼠皮肤切口瘢痕形成的实验研究

李 杨 朱 飞

瘢痕是正常皮肤组织创伤后引起的形态学和组织病理学变化的总称。一般认为胶原合成和降解的不平衡、黏液多糖的异常和成纤维细胞的增殖导致了瘢痕的形成，以成纤维细胞异常增生和胶原、细胞外基质异常沉积为特点。TGF-β是近年来研究较多的与瘢痕相关的生长因子，其中TGF-β 1、TGF-β 2能促进瘢痕增生，而 TGF-β 3能抑制瘢痕的形成[1]，相关实验结果证明通过应用外源性TGF-β 3或用抗体、拮抗剂等减轻瘢痕[2]。TGF-β 1是影响组织纤维化发展和形成的关键细胞因子，同时可以诱导上皮-间质转化、促进成纤维细胞增生与转化、促进细胞外基质沉积以及诱导其他纤维化因子的表达[3]。吡非尼酮（PFD）是一种新的具有广谱抗纤维化作用的吡啶酮类化合物，化学名为5甲基1苯基2-（1 H）吡啶酮，其能够防止和逆转纤维化和瘢痕的形成。相关研究表明吡非尼酮是通过抑制TGF-β和肿瘤坏死因子（TNF-α），从而发挥抑制成纤维细胞增殖以及胶原沉积的作用[4]。本实验原理基于瘢痕形成的机制以及吡非尼酮在调节 TGF-β 1表达和干预成纤维细胞增殖和胶原沉积中的作用，推测吡非尼酮可能对皮肤瘢痕的防治有一定的作用。通过建立大鼠背部皮肤线性切口瘢痕模型，探索吡非尼酮在大鼠切口皮肤瘢痕形成中的作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 吡非尼酮（北京康蒂尼药业有限公司），乳膏基质（陕西齐立达生物科技有限责任公司），大鼠转化生长因子β 1酶联免疫分析试剂盒（货号：JYM0636Ra ；批号：GR201809-1武汉基因美科技有限公司），酶标仪RT-6000（雷杜），离心机JW3021HR（安徽嘉文），漩涡混合器GL-88B（其林贝尔仪器制造公司）。

1.2 实验动物 普通级别 SD 大鼠雄性32只，健康，体质量200 g，由安徽省实验动物中心提供。

1.3 模型的建立 32只雄性SD大鼠，术前使用10%水合氯醛（由实验室配置）麻醉，麻醉后剃除大鼠背部毛发，剃毛后于脊柱两侧各行2个纵向平行的切口，双侧对称，长约1.5 cm，深至筋膜。切口不予以缝合。老鼠饲养过程单笼饲养，1鼠1笼，避免大鼠间相互啃咬切口。每只大鼠的 4个切口，每个切口均都可视为一个独立的样本。

1.4 分组及给药方法 32只大鼠建立模型后共128个切口，分为4个组:A组(实验过程中不进行任何处理) ;B组（外用空白乳膏基质）；C组（4%吡非尼酮乳膏组）; D组（8% 吡非尼酮乳膏组）。每只大鼠4个切口分为不同组。每天换药1次，一次用药约0.5 g，正常饲养，14 d后麻醉处死大鼠。取瘢痕组织标本，经10%福尔马林固定后,包埋,切片,分别进行HE染色和Masson染色。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肉眼观察 2～3天大鼠切口结痂，1周后有大鼠切口开始愈合，各组切口愈合时间（见表1），低浓度实验组与高浓度实验组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），实验组愈合时间较对照组长。A组、B组肉眼可见瘢痕无明显区别，C组、D组瘢痕较A组、B组稍平，颜色变淡，C组、D组瘢痕间肉眼观察未见明显区别。

2.2 HE及Masson染色观察 组织切片HE染色后镜下观察真皮层可见炎性细胞及成纤维细胞。成纤维细胞呈梭型，散在分布胶原纤维中，瘢痕区较周围正常的皮肤组织成纤维细胞数目明显增多。瘢痕组织切片Masson染色后，可见胶原纤维呈蓝色，肌肉染成红色。镜下可见A组、B组胶原纤维蓝染颜色较明显，纤维排列紊乱，粗大；而C组、D组胶原纤维排列整齐，形态纤细。见图1。

图1 吡非尼酮乳膏连续给药14天后大鼠背部切口瘢痕组织切片H染色图×100

2.3 成纤维细胞计数 HE 染色的组织切片光学经显微镜 400 倍放大观察，通过随机计数3个不重叠视野的成纤维细胞数量，每个视野由2位实验者同时计数，求其平均值，比较各组FB的数目（见表1）。FB在HE染色下无特殊染色，判断FB指标为细胞外形呈梭形，核仁明显。通过对表1及表2数据进行软件分析，A组与B组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；C组、D组分别与A组、B组比较，成纤维细胞明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），D组与C组比较，成纤维细胞减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 大鼠背部切口愈合后瘢痕组织内纤维细胞数目及愈合时间（n=32，x±s）

表2 大鼠背部切口愈合后瘢痕组织内TGF-β 1的表达量（n=32，x±s）

2.4 ELISA 测定 根据TGF-β 1标准品的吸光值，以浓度为横坐标，OD值（用450 nm波长连续测量每个孔的吸光度)为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线（见表3）。根据样品的OD值，用标准曲线求出相应的浓度，再乘以稀释倍数。或用标准物质浓度和OD值计算标准曲线的线性回归方程。标准曲线检测范围为3～200 pg/mL（r2=0.9998）。将样品的OD值代入方程，计算样品的浓度，再乘以稀释倍数，即样品的实际浓度。用SPSS13.0软件比较各组TGF-β 1的表达（见表2），A组和B组的表达情况，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组、D组分别与A组、B组比较，TGF-β 1表达减少，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；D组与C组比较，TGF-β 1表达减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表3 TGF-β1标准品浓度与OD值

图2 TGF-β1浓度与吸光度曲线

3 讨 论

当皮肤受到较重损伤后，往往会形成难愈性瘢痕，尤其是在较明显部位时，会对患者的生理和心理产生巨大影响。目前常用的瘢痕治疗方式主要以手术切除治疗为主、同时辅助以激素注射治疗、放射治疗等[5]，但是这些方法都不能完全治愈瘢痕。随着近些年来有关瘢痕形成机制的研究，对瘢痕的治疗，也有了更深入的认识，认识到针对瘢痕的治疗，要预防与治疗相结合。

目前的瘢痕治疗主流观点是在创伤后早期、瘢痕尚未完全形成时就给予及时的干预和治疗。就目前来说对切口的早期干预主要针对于切口愈合的两个阶段，第一个阶段，即瘢痕组织开始形成前的阶段，此阶段伤口的上皮开始覆盖切口；第二个阶段，即瘢痕开始形成的阶段。尽早干预的目的主要在于抑制瘢痕的形成以及降低后期瘢痕形成过程中进一步发展的风险，即从源头上抑制瘢痕的生长，同时规避各种可能造成瘢痕增生的危险因素，从而达到在根本上治愈瘢痕的目的。吡非尼酮的药效主要为抗纤维化作用，临床上主要用于肺纤维化的治疗，具有比较好的效果，而其抗纤维化的主要机理是通过调节TGF-β、结缔组织生长因子、肿瘤坏死因子α等信号转导分子的表达,从而实现抗纤维化。成纤维细胞是切口愈合的主要修复细胞之一, 它在切口修复过程中活化、增殖、合成胶原及分化的异常直接导致病理性瘢痕的形成，同时相关研究表面瘢痕形成过程中成纤维细胞中的TGF-β 1 mRNA表达较正常皮肤明显增加。TGF-β在创伤修复过程中起着至关重要的作用，TGF-β参与了创伤修复的全过程，TGF-β通过刺激成纤维细胞的分化、转化及增生；诱导细胞外基质的合成与沉积；同时抑制胶原酶的产生，使瘢痕组织持续增生，过度纤维化，其中 TGF-β 1可促进成纤维细胞的增殖、促进细胞外基质的产生和抑制胶原降解,被认为是瘢痕纤维化中的最重要的生长因子。因此吡非尼酮可以通过对TGF-β 1的抑制作用，从而达到抗瘢痕的作用。蓝蔚等[6]研究表明，吡非尼酮对体外人体增生性瘢痕成纤维细胞有抑制作用。Armendariz-Borunda J等学者[7]观察了通过外用吡非尼酮凝胶治疗儿童烧伤后瘢痕与压力疗法对比，发现吡非尼酮凝胶对瘢痕有一定的治疗效果且高于压力疗法的疗效。

一定量的转化生长因子-β能够促进伤口的修复。在皮肤创伤的修复实验中，皮肤受创后的短时间内就能够观察到转化生长因子-β被激活并表达，进而促进成纤维细胞的增殖和细胞外基质的沉积，加速切口愈合。但在切口修复的后期，瘢痕形成过程中，转化生长因子-β的过度表达却可能直接导致瘢痕的形成。转化生长因子-β 1还与血管内皮生长因子的上调有关，还能促进切口成纤维细胞收缩以增加胶原基质的收缩，因此在理论上来说阻断转化生长因子-β 1信号会造成创口慢性愈合。本实验通过对大鼠创伤后切口瘢痕形成过程中使用吡非尼酮乳膏，通过干预使实验组瘢痕形成过程中的TGF-β 1表达降低，从而抑制成纤维细胞的增殖，抑制胶原合成，最终达到抑制瘢痕形成的效果。通过调整所用吡非尼酮乳膏浓度，发现随着用药浓度的增加，TGF-β 1的表达进一步降低，同时高浓度用药组的成纤维细胞也较低浓度用药组的成纤维细胞数目减少，表明在一定的药物浓度内吡非尼酮对瘢痕形成的抑制作用可能与用药浓度成正相关性。

综上所述，吡非尼酮可能作为一种新的治疗瘢痕的药物，且在一定用药浓度内，疗效与浓度呈正相关，但可能会延长切口愈合时间。