基于16S rDNA高通量测序的玉米根际与非根际土壤细菌多样性比较

徐丽霞，何永吉

（1.山西药科职业学院中药系，山西太原030031；2.山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原030031）

根系是植物和土壤之间物质和能量的重要界面，也是土壤微生物活动最活跃的部分[1-2]。植物根系特定分泌物和土壤养分相互作用形成了独特的养分组成和微生物群落组成。有研究表明，玉米、大针茅和刺槐根际土壤中的有效氮（AN）、有效磷（AP）和有机碳（SOC）含量明显高于非根际土壤[1-4]；在刺槐的研究中发现，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度在根际土壤中高于非根际土壤[4-5]。土壤细菌是土壤生态系统的重要组成部分，占土壤微生物总量的90%以上。植物根际土壤细菌参与了有机质的形成和转化，N、P和K的循环以及植物激素和抗生素的分泌，为植物免受病原体侵害和植株健康生长提供了保障[6]。

玉米（Zea maysL.）作为我国一种重要的粮食作物，广泛种植于全国各地，产量居粮食作物第一[7-9]。近年来，玉米种植中化肥的施用不仅提高了土壤中N、P和K的含量，也改变了根际土壤细菌群落的结构；但关于玉米根际土壤养分与细菌多样性的关系的研究甚少。

本试验应用高通量测序技术对玉米根际和非根际土壤细菌的16S rDNA的V3-V4可变区进行分析，研究N、P、K和有机肥配合施肥条件下，玉米根际和非根际土壤细菌多样性的差异，以探究玉米根际土壤养分与特定细菌类群的关系，为寻找玉米根际土壤中利于养分循环的细菌类群提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验在山西省晋中市东阳镇试验田进行。该地区位于北纬 37°35′，东经 112°51′；年平均气温为9.7℃，降水量为440.7 mm。试验进行前，所有地块均种植玉米。播种前施基肥：尿素141 kg/hm2、重过磷酸钙141 kg/hm2、硫酸钾145 kg/hm2和有机肥3 000 kg/hm2。其中，有机肥为猪粪，含水55%、总氮16.5 g/kg、P2O523.6 g/kg 和 K2O 15.8 g/kg；7 月底追施尿素100 kg/hm2。每个试验处理设3个重复小区，每小区50 m2，行距和株距分别为70，25 cm。

1.2 土壤样品的采集

2018年7月追肥前，分别在3个小区随机采集玉米15株，先轻轻抖落根系外围土壤作为非根际土壤（NRS）；再用毛刷轻轻刷下根表面土壤，均匀混合15株玉米根际的土壤视作根际土壤（RS）。混合样品分别过0.5 mm筛，并分为2份，其中一份风干用来测定土壤养分；另外一份保存于-80℃用于土壤细菌多样性检测。

1.3 土壤养分含量的测定

采用碱解扩散法测定裂解氮（AN）含量；采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法测定有效磷（AP）含量；采用乙酸铵浸提-原子吸收分光光度法测定有效钾（AK）含量；采用凯氏定氮法测定全氮（TN）含量；采用碱熔-钼锑抗分光光度法测定全磷（TP）含量；采用氢氧化钠熔融-火焰原子吸收分光光度法测定全钾（TK）含量；采用重铬酸钾外加热法测定有机碳（SOC）含量[10]；用SOC/TN表示土壤碳氮比（C/N）。

1.4 土壤DNA提取和细菌多样性检测

使用土壤DNA试剂盒（USAE.Z.N.A.R）从0.5 g土壤中提取DNA。采用细菌通用引物338F：5′-AC TCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R：5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′扩增土壤样品细菌16S rDNA的V3-V4可变区，并用Illumina技术进行测序[11]。PCR 条件为 94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，71℃30 s，25个循环；71℃5 min。原始数据质量控制过程中，丢弃模糊碱基和低质量序列，最终序列长不能低于150 bp。对过滤后的序列进行连接，连接后的序列不低于10 bp，并去除嵌合体和错配碱基[12]。在序列相似度97%的情况下，将高质量序列聚类为Operational Taxonomic Unit（OTU），用于种群分类。

1.5 数据分析

通过寻找最近祖先的方法，获得每个样品的OTU分类信息。使用Qime将修剪序列与Green Gene数据库进行比较，以对每个分类群进行丰度计算和分类，并进行分类到属级别的OTU丰度比较。样本中的差异显著性用SPSS软件进行独立样本T检验检测。柱形图采用Sigmaplot绘制，*表示显著差异（P＜0.05）；冗余分析采用Canoco5.0软件完成；采用R软件进行细菌群落非度量多维尺度分析。

2 结果与分析

2.1 施肥对玉米根际和非根际土壤养分含量的影响

N、P、K和C是植物生长的必需营养元素[13]，对玉米产量的形成有着重要的意义。从表1可以看出，AN、AP、SOC和C/N在根际土壤中较非根际土壤中显著升高，分别升高26.61%，32.07%，73.32%和57.60%；而AK、TN、TP和TK在2种土壤中差异不大。

表1 不同样品中养分含量的测定结果

2.2 施肥对玉米根际和非根际土壤细菌群落多样性的影响

从表2可以看出，6个土壤样品的全部测序数据包含286 028条有效序列，其中，优质序列有230 636条，占总序列的80.63%。通过数据库比对，检测到的有效序列主要分布在45个已知细菌门。根际土壤较非根际土壤能更确切地反映玉米根际土壤微生物的变化情况，施肥也是影响玉米根际土壤细菌群落变化的主要因素。结果表明，与非根际土壤相比，Chao和Shannon指数在玉米根际土壤中显著升高，而Simpson指数的变化则在玉米根际土壤中显著降低。

表2 不同样品中土壤细菌多样性指数和测序序列

2.2.1 施肥对玉米根际和非根际土壤细菌多样性在门水平上的影响 在门的分类水平上，有10个细菌门，在玉米根际和非根际土壤样品中占细菌总数的96%～97%。结果表明，与非根际土壤相比，根际土壤中Proteobacteria、Actinobacteria和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度均增加，分别增加了9.82%，5.00%和3.42%；Acidobacteria、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）和浮游菌门（Planctomycetes）的相对丰度均降低，分别降低了11.73%，1.36%，2.09%和7.11%；疣微菌门（Verrucomicrobia）、绿屈挠菌门（Chlor of lexi）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度在根际和非根际土壤样品中差异不大（图1）。

2.2.2 施肥对玉米根际和非根际土壤细菌多样性在属水平上的影响 从图2可以看出，有44个属在至少一个样品中的相对丰度大于0.1%，且Lysobacter、Pseudomonas、Nocardioides、Bacillus、Balneimonas、Chitinophaga、Saccharothrix和Streptomyces等 37个属的相对丰度在根际土壤中显著高于非根际土壤，且Kribbella的丰度最大，为1.73%；Bradyrhizobium、Gemmata和Planctomyces等7个属的相对丰度在非根际土壤中显著高于根际土壤，其中，Planctomyces的丰度最大，为2.89%。对44个属在2个土壤样品中的相对丰度进行非度量多维尺度分析，结果显示（图3），不同的土壤样品分别聚在一起，彼此分离，但根际与非根际土壤细菌类群间差异不显著（F＝546.33，P＝0.1）。

2.2.3 土壤养分和细菌群落的关系 冗余分析结果显示，土壤养分与细菌在门和属水平上相对丰度的关系如图4所示。由图4-a可知，在门的水平上，第1轴和第2轴分别解释了变量的92.58%和3.46%；Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia和Bacteroidetes的相对丰度与AN和SOC含量及C/N呈正相关，Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相对丰度与AP含量呈正相关。图4-b结果显示，在属的水平上，第1轴和第2轴分别解释了变量的99.32%和 0.05%；Bacillus、Chitinophaga、Pseudomonas、Lysobacter、Nocardioides、Balneimonas、Saccharothrix和Streptomyces的丰度与AN和SOC含量及C/N呈正相关；Bradyrhizobium的丰度与AK的含量呈正相关，与AN和SOC的含量及C/N呈负相关；Gemmata和Planctomyces的相对丰度与AK呈负相关，与AP呈正相关。

3 结论与讨论

植物根系产生的分泌物能形成特定的根周环境及根际土壤独特的理化性质和微生物群落分布。前人研究表明，根际土壤中AN、AP和SOC的含量提高，更有利于作物根系的吸收，并通过植物体内转运保障作物产量稳定[1-4]，这与本试验的部分研究结果一致。C/N＝25是土壤微生物分解有机质的最适值；C/N＞25时表明氮素缺乏；C/N＜25时可促进微生物的生长并释放多余的氮，利于植物生长[14]本研究中，根际土壤中AN，AP和SOC含量较高时，C/N为10.85，为微生物的繁殖提供了有利的环境。

Chao和ACE指数越大说明土壤样品中微生物物种的丰富度越高[12]；Simpson指数越大说明样品中优势种越多，其他非优势物种所占的比例则会减少，群落多样性就越低[15]。玉米根际土壤中，Chao和ACE指数在根际土壤中高于非根际土壤，Simpson指数则反之。说明根际土壤中有较高的微生物多样性，并有一些特定的优势菌群。

本研究表明，在门的水平，Proteobacteria和Actinobacteria的相对丰度在根际土壤中显著高于非根际土壤。有研究表明，Proteobacteria和Actinobacteria是富营养菌，适宜生长在营养丰富的土壤中，这与根际土壤中有较高的AN、AP和SOC密切相关[16]。在属的水平，根际土壤中Bacillus、Chitinophaga、Pseudomonas、Lysobacter、Nocardioides、Balneimonas、Saccharothrix和Streptomyces的相对丰度高于非根际土壤。前人研究发现，Bacillus具有溶解磷、固氮、降解蛋白质等生物聚合物和促进植物生长的功能[17-18]；Streptomyces能够分泌固氮酶、植物激素IAA、多胺和抗生素[19-20]；Balneimonas被重新分类为Microvirga，而Microvirga的一些物种有固氮功能；Pseudomonas可以降解土壤中的醇、醚和农药甲拌磷，并有助于腐殖质的形成[21-23]；Flavobacterium能分泌多种酶来降解各种碳源，形成良好的土壤环境[24]；Chitinophaga降解多糖和蛋白质分泌物[25]；Nocardioides降解多菌灵等含有苯环的有机物[26]；Lysobacter和Saccharothrix能够分泌抗生素作为生物抑菌剂[27-28]。Bradyrhizobium和Gemmate在非根际土壤中显著高于根际土壤，研究表明：Bradyrhizobium与豆科植物共生固氮，并能溶解磷酸盐，产生铁载体，抑制一些病原体，如镰刀菌、丝核菌和壳球孢菌[29-30]；Gemmate可促进脲酶的分泌，脲酶可促进酰胺类物质分解，进而提高有机质的利用率[29]。结合以上研究结果推断，玉米根际和非根际土壤中的Bacillus和Bradyr-hizobium可能参与溶磷和固氮；Streptomyces和Balneimonas可能参与固氮；Pseudomonas、Gemmate和Flavobacterium可能参与有机质的分解和循环。

玉米根际土壤较非根际土壤有较高丰度的可利用养分和细菌多样性。根际土壤中较高丰度的功能菌属如Bacillus、Balneimonas、Pseudomonas、Flavobacterium和Streptomyces属，可能参与土壤中有机质、N和P的循环和利用。玉米根际为功能细菌的生存提供了特定的土壤微生态环境，功能细菌增强了根际土壤养分的循环和玉米的吸收，保障了玉米产量的稳定。