丹参组织培养及快速繁殖

董静静，白凤麟，刘瑞祥，雷海英，窦彩霞

（长治学院生物科学与技术系，山西长治046011）

丹参（Salvia miltiorrhizaBge.），又名紫丹参、血参、大红袍等,为双子叶唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物[1]，主要以干燥根及根茎入药[2]。目前，从丹参中分离到的化学成分有100多种，分为水溶性和脂溶性2类。研究发现，发挥丹参药理药效的主要成分是水溶性的酚酸类和脂溶性的丹参酮类[3-5]。丹参酮类是一类松香烷型二萜醌类化合物，主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮、异丹参酮I、异隐丹参酮[6-8]；丹参酮类物质大多从丹参根茎中提取得到[9]。此外，丹参还含有黄酮类、三萜类等成分，具有改善循环、抑制血小板凝聚、减少心肌损伤和抗氧化的作用[10-14]，常配伍用于治疗心脑血管疾病炎症、肝硬化等[15-17]。近几年，随着我国心脑血管类疾病发病率的上升，丹参的需求量逐年增加[18-19]。

本研究以丹参叶片为外植体，通过设置培养基的激素种类和浓度梯度，探索有效获得丹参叶片愈伤组织高诱导率、较佳生长速度的激素配比，从而得到一套实用的丹参快速繁殖技术，旨在为改良丹参质量、提高丹参产量和有效成分以及为丹参种植提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料与主要试剂

供试丹参叶片来源于山西振东道地药材开发有限公司。主要试剂有氯化汞，无水乙醇，95%乙醇，2，4- 二氯苯氧乙酸（2，4-D），6- 苄氨基腺嘌呤（6-BA），MS培养基所需药品，蔗糖，氯化钠，琼脂粉，氢氧化钠，萘乙酸（NAA），吲哚丁酸（IBA）。

1.2 试验方法

1.2.1 丹参叶片消毒 采集大田生长的丹参叶片，用自来水冲洗掉表面的泥沙，放在超净工作台进行进一步消毒。将外植体放在无菌的培养皿中，用75%的酒精浸泡10 s左右，用无菌水漂洗3～4次，每次1～2 min；向培养皿中加入0.1%的氯化汞溶液，振荡浸泡10 min，倒去浸泡过材料的氯化汞，用无菌水漂洗3～4次，每次1～2 min，并用无菌镊子不停搅拌。

1.2.2 丹参叶片愈伤组织的诱导 将丹参叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，用无菌滤纸吸掉叶片表面水分并放入无菌培养皿中，使用无菌镊子接种于附加不同浓度6-BA和2，4-D的MS固体培养基上（表1），记录愈伤的增殖效应以及后期的长势情况。在黑暗条件下诱导形成愈伤组织，培养温度为（25±1）℃。每隔5 d观察一次外植体的生长状况，统计初始愈伤时间、染菌个数，计算愈伤组织诱导率。

表1 不同浓度激素配比的愈伤组织诱导培养基

1.2.3 不同激素配比对诱导芽的影响 将愈伤组织继代培养后，挑选长势良好的愈伤组织，接种于附加不同激素浓度的MS固体培养基[20]（表2），记录愈伤的增殖效应以及后期的长势情况。培养温度为（25±1）℃，光照培养，记录不同浓度梯度培养基上最早的出芽点时间以及后期芽的长势情况。30 d后，计算愈伤组织的萌芽数和萌芽率。

表2 不同浓度激素配比的愈伤组织芽诱导培养基

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对丹参叶片愈伤组织的影响

把叶片接种在2，4-D质量浓度为0.5 mg/L、6-BA质量浓度分别 0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L的 MS培养基上进行愈伤组织诱导，结果表明，当6-BA质量浓度为0.5，1.0 mg/L时，丹参叶片长出愈伤组织时间最长，需要20 d左右，但其愈伤质量不佳；6-BA质量浓度为1.5，2.0 mg/L时，出愈时间约14 d，愈伤组织呈淡黄色且较大，无褐化现象（表3）。

表3 不同浓度激素配比对丹参叶片愈伤组织诱导的影响

把叶片接种在6-BA质量浓度为1.0 mg/L、2，4-D质量浓度分别为 1.0，1.5，2.0，2.5 mg/L的 MS的培养基上，结果表明，当2，4-D质量浓度为1.0mg/L时，愈伤组织长势良好，呈淡黄色；当2，4-D质量浓度为1.5 mg/L时，愈伤组织较大，呈淡黄色，致密，无褐化，愈伤增殖快；当2，4-D质量浓度为2.0 mg/L时，叶片长出愈伤时间最短，大约7 d，叶片切口皱缩、变厚，开始从叶片切口长出愈伤组织，且愈伤呈现淡黄色，生长后期愈伤组织不仅增殖快，而且没有分化出芽，不褐化；当2，4-D质量浓度为2.5 mg/L时，愈伤组织虽然长势快，但是褐化比较严重。可能是由于2，4-D质量浓度过高，导致愈伤组织内多酚氧化酶活性升高，而使愈伤组织褐化[21]。可见，2，4-D对愈伤组织的诱导影响较大，最适质量浓度范围是1.0～2.0 mg/L，浓度太低不利于诱导愈伤，浓度太高会影响愈伤质量；增加6-BA浓度可以增加出愈率，但后期愈伤长势不佳。综合考虑，MS＋1.0 mg/L6-BA＋2.0 mg/L2，4-D可作为诱导丹参叶片愈伤组织的最佳培养基（表3）。

2.2 不同激素配比对丹参愈伤组织诱导芽的影响

选取在诱导培养基上长势最好的愈伤组织诱导芽，进而探索不同激素浓度梯度对诱导芽的影响。由表4可知，在单独使用6-BA诱导芽时，愈伤组织增殖速度快，6 d左右愈伤组织明显长大，但是褐化现象严重，并且有大部分愈伤分化出根。说明6-BA单独使用不利于诱导芽。在添加6-BA的基础上再添加NAA，观察6-BA和NAA这2种激素配比对诱导芽的影响，结果发现，没有长根现象发生，约4 d后在2.0 mg/L6-BA＋0.25 mg/LNAA的培养基上最先出现芽点，10 d后愈伤组织全部呈现淡绿色；7 d后，在1.5 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA培养基上出现芽点；而0.5mg/L6-BA＋0.25mg/LNAA和1.0mg/L6-BA＋0.25mg/LNAA的培养基上约15d才出现芽点。说明2.0 mg/L的6-BA与一定浓度的NAA配比使用能较高效率地诱导芽。

表4 不同浓度激素配比对丹参愈伤组织诱导芽的影响

3 结论与讨论

本试验结果表明，丹参愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS＋1.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2，4-D，其中，2，4-D对愈伤组织诱导的影响较大，浓度太低不利于诱导愈伤，浓度太高会影响后期愈伤质量，导致愈伤褐化；增加6-BA浓度可以提高出愈率，但愈伤质量较低。

试验结果表明，诱导愈伤分化芽的最适培养基为MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA，试验中发现，单独使用6-BA不利于诱导芽，与一定浓度的NAA配比使用能较高效率地诱导芽。

本研究探索了不同激素种类和浓度配比对丹参愈伤组织诱导芽的影响，为丹参提供了一套高效、快速、稳定的繁殖方法，进而为丹参的快速繁殖提供了技术支持。